超速離心分離蛋白多聚體

1、水平轉(zhuǎn)頭也稱吊桶式轉(zhuǎn)頭。靜止時(shí)離心管垂直掛在轉(zhuǎn)頭上，當(dāng)轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速達(dá)一定速度后達(dá)到水平位置，通常轉(zhuǎn)頭的吊桶要滿掛。水平轉(zhuǎn)頭結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，容量也相對(duì)小一些。 角轉(zhuǎn)頭的離心管腔與轉(zhuǎn)軸保持固定角度。由于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可裝載較多的樣品和使用較高的轉(zhuǎn)速。上樣量與離心轉(zhuǎn)頭和離心管的選擇都有關(guān)。我們實(shí)驗(yàn)室就有一臺(tái)BECKMAN超速離心機(jī)，配有水平轉(zhuǎn)頭和角轉(zhuǎn)頭，角轉(zhuǎn)頭最高轉(zhuǎn)速可達(dá)70 000轉(zhuǎn)，水平轉(zhuǎn)頭最高轉(zhuǎn)速也可達(dá)60 000轉(zhuǎn)（所以超速離心并不都是角轉(zhuǎn)的），各自配備的離心管容量相差也很大。本實(shí)驗(yàn)室：28000rpm/min，18h，蔗糖梯度40%-70%，每管容量大概35ml，其中蔗糖密度梯度32.5ml，樣品2

2、.5ml（管子必須裝滿，否則會(huì)離碎。樣品只與體積有關(guān)，濃度越高，可提高上樣量），目的是為了分離四聚體（240KDa）和三聚體(180KDa)。離心18h后，分管收集，每管3.5ml左右，切記從最底部緩慢用針管吸出或用泵泵出。之后透析掛柱子。· 密度梯度離心基礎(chǔ)余興明 中科院上海生物化學(xué)研究一、 概論在密度梯度離心中單一樣品組份的分離是借助于混合樣品穿過密度梯度層的沉降或上浮來達(dá)到的。梯度液的密度隨著離心半經(jīng)的增大而增加。密度梯度可以予形成，也可以在離心過程中自形成，經(jīng)常，密度梯度的可以分為：速率一區(qū)帶（Rate-30nal）離心和等密度（Isopycnic）離心。在速率一區(qū)帶離心中混

3、合樣品的以很薄的一層鋪在梯度液的上部，在離心過程中由于不同組份"顆粒"在梯度液中沉降速率的差別，而在離心的某一時(shí)刻形成了數(shù)個(gè)含有第一級(jí)份顆粒的"區(qū)帶"。離心過程在最垂"的樣品（或者說沉降得最快的樣品）形成沉淀前就停止了。樣品在離心后與梯度液一起收集，用常規(guī)技術(shù)去除梯度材料后就得了某個(gè)較純的成份。每個(gè)單一組份的沉降速率取決于它們的形狀、尺寸、密度、離心力的大小、梯度液的密度和粘性系數(shù)。對(duì)于相類似的生物體組份常常形狀也相似。在速率區(qū)帶離心中我們常使梯度液的最大密度不超過樣品在該梯度中浮密度。利用這類生物組份在尺寸上的差異的形成的沉降速率的不同，選擇

4、某一特定時(shí)刻，當(dāng)它們中的各個(gè)純樣品區(qū)帶之間的距離拉得最遠(yuǎn)時(shí)停止離心即可以達(dá)到分離目的。與速率一區(qū)帶離心法不同的是，等密度離心是依賴于樣品顆粒的不同密度來進(jìn)行離心分離的。混合樣品可以鋪在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至和梯度液混在一起。最后一種方法依靠離心力來形成梯度（自形成梯度）在形成梯度的過程中由于樣品各單一成份向它們自己的等密度區(qū)靠擾即達(dá)到了分離純化的目的。對(duì)于速率一區(qū)帶離心，梯度液最大密度一般小于樣品中各組份的密度，也就是說是在樣品正在沉降過程中的不是在形成沉殿后來分離樣品；而等密度離心法中，梯度液的初始最大密度常常超過樣品各組份的密度，利用每個(gè)單一組份沉降或上浮到它們各自的等密度

5、區(qū)來達(dá)到分離的目的。密度梯度離心法的理論依據(jù)是（參考文獻(xiàn)1）每種純樣品成份在梯度液中的沉降速度可以表達(dá)為：V=d2÷18×(-s)÷×2r式中V是某一時(shí)刻樣品的沉降速度（厘米/秒）d：樣品顆粒的直徑（厘米），我們?cè)诔醪接?jì)算時(shí)就假說樣品顆粒為球體。非球形顆粒樣品，可以以上式為基礎(chǔ)進(jìn)行修正。：樣品顆粒的密度（克/厘米3）s：密度梯度液的密度（克/厘米3）：密度梯度液的粘性系數(shù)（克/厘米·秒）：離心機(jī)重軸的旋轉(zhuǎn)角速度（1/秒），=2N÷60，N：轉(zhuǎn)/分r：顆粒所在位置與旋轉(zhuǎn)軸心之間的距離，即離心半徑（厘米）· >S時(shí) V&g

6、t;0即樣品順離心力方向沉降<S時(shí) V<0即樣品逆離心力方向上浮=S時(shí) V=0即樣品停止沉降或上浮，"穩(wěn)定"在這一位置用這個(gè)公式可以很好地解釋在速率一區(qū)帶離心法或等密度離心法中單一樣品的沉降（或上?。┬袨椤６?、 轉(zhuǎn)頭的選擇：1、 離心轉(zhuǎn)頭分類：轉(zhuǎn)頭類別 使用的離心機(jī) 發(fā)明時(shí)間、發(fā)明者或推廣商固定角式轉(zhuǎn)頭 低、高、超 1943年，（英）Pickels甩平轉(zhuǎn)頭 低、高、超速 1951年，（德）Kahler垂直管轉(zhuǎn)頭 高、超速 1974-1975年，（美）Dupont公司區(qū)帶轉(zhuǎn)頭 低、高、超 1964-1965年，（英）Anderson、（英）MSE公司近垂直管轉(zhuǎn)頭

7、超速 1989年，（日）Hitachi Koki、（美）Beckman公司連續(xù)離心轉(zhuǎn)頭 低、高、超 1965年，（英）MSE公司其他特種轉(zhuǎn)頭：分析轉(zhuǎn)頭，土壤脫水轉(zhuǎn)頭，細(xì)胞浮選轉(zhuǎn)頭，管式轉(zhuǎn)頭，血球比測(cè)定轉(zhuǎn)頭，細(xì)胞清洗轉(zhuǎn)頭等等。2、 各種轉(zhuǎn)頭用于密度梯度離心的比較：（I） 各種轉(zhuǎn)頭用于速率一區(qū)帶（R-z）離心的優(yōu)缺點(diǎn)分析：固定角式轉(zhuǎn)頭：壁部放應(yīng)影響很大，用于R-z離心回、收率低，純度也受影響一般知用于差分離心和等密度離心，離心時(shí)間向較短。是各其離心機(jī)的最高速轉(zhuǎn)頭。甩平轉(zhuǎn)頭：細(xì)長(zhǎng)離心管用于R-z離心可以獲得較高純度和高分辨率，且容易控制離心時(shí)間，壁部入在很少。25000rpm30000rpm的甩平轉(zhuǎn)

8、頭最適用于亞細(xì)胞器的離心分離，而4000042000rpm的甩平轉(zhuǎn)頭適合用于核酸、蛋白、病毒草類物質(zhì)內(nèi)流的分離。離心時(shí)間較長(zhǎng)。垂直管轉(zhuǎn)頭：沉降距離最短，因而離心分離時(shí)間也是短。最大半徑前幾乎沒有壁部放位，最大本徑后右一定壁部效位，垂直剖面積較大，因而離心后純樣品區(qū)帶的容量也較大。但在有沉殿的密度梯度離心中，沉淀和浮動(dòng)區(qū)帶方向轉(zhuǎn)換之間存在干擾，可能影響純樣品區(qū)帶的純度。大部份R-z離心沒有沉殿，垂直管轉(zhuǎn)頭很適合做R-z離心。近垂直管轉(zhuǎn)頭：管軸線與旋轉(zhuǎn)主軸之間傾角7度9度（角式轉(zhuǎn)頭20度45度）沉降距離比垂直轉(zhuǎn)頭稍大，離心時(shí)間比角式，甩平轉(zhuǎn)頭都要短。由于右了傾角，沉殿可沿管壁滑向低部，因此基本上清

9、除了沉殿與浮動(dòng)區(qū)帶轉(zhuǎn)換之間的干擾，適合做R-z離心，特別適合做生物大分子（如質(zhì)粒DNA）的自形成梯度等密度離心。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：沒有壁部入應(yīng)特別適合做大容量的病毒，亞細(xì)胞器，生物大分子的R-z離心，可用于研究，中試和少批量生產(chǎn)。分離純度高，量大，但操作要求高，轉(zhuǎn)頭及整體價(jià)格昂貴。連續(xù)流離心轉(zhuǎn)頭：工作原理的區(qū)帶轉(zhuǎn)頭相似，可連續(xù)工作，分離量大，分離統(tǒng)純度高，可用于各種生物體的差分，R-z等密度離心。近年來高速連續(xù)流轉(zhuǎn)頭常用于大量發(fā)酵液（大腸樣菌、醞母菌）菌體的沉淀。（II） 各種轉(zhuǎn)頭用于等密度離心內(nèi)優(yōu)缺點(diǎn)分析：固定角式轉(zhuǎn)頭：主要用于差分離心的角式轉(zhuǎn)頭，在速離心機(jī)上可以很好地用于等密度離心，尤其是DNA平

10、衡等密度離心，自形成梯度，用快速密封管或厚壁管，常用的單管的容量為1015ml,常用轉(zhuǎn)速4000060000rpm，離心時(shí)間較短，分離純度也較高。甩平轉(zhuǎn)頭：用作等密度離心時(shí)，壁部效應(yīng)對(duì)分離效果影響較少，梯度變換在甩平時(shí)自然過渡因而很適合做等密度離心實(shí)驗(yàn)，優(yōu)點(diǎn)是回收率高，分辨能力強(qiáng)。缺點(diǎn)是沉降距離長(zhǎng)，最高轉(zhuǎn)速較低（由于結(jié)構(gòu)層固此類轉(zhuǎn)頭最主轉(zhuǎn)速一般在60000rpm以下）因而，離心時(shí)間很長(zhǎng)，對(duì)某些長(zhǎng)離心管，1015ml容量的轉(zhuǎn)頭最高轉(zhuǎn)速在4000041000rpm，用作自形成CSCL梯度的質(zhì)粒DNA離心往往需要5070小時(shí)。垂直管轉(zhuǎn)頭：適合作等密度離心，沉降距離最短，在沒有沉殿或沉殿非常堅(jiān)實(shí)的情況

11、下，對(duì)于現(xiàn)代可自由選擇加速、減速時(shí)間的離心機(jī)，梯度轉(zhuǎn)換得很好。這類轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)進(jìn)很高（目前最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000rpm，70000xg）離心時(shí)間最短，分離純度高，樣品容量較大（垂直剖面積最大）。近垂直轉(zhuǎn)頭：九十年代以后開始使用的新型轉(zhuǎn)頭，用作生物大分子（DNA，RNA，蛋白質(zhì)等）的平衡等密度離心最佳，目前這類轉(zhuǎn)頭的最高轉(zhuǎn)速已達(dá)90000rpm近650000xg），離心時(shí)間相比垂直轉(zhuǎn)頭稍長(zhǎng)。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：非常適合做大容量樣品的等密度離心連續(xù)流離心轉(zhuǎn)頭：高、低速連續(xù)流轉(zhuǎn)頭一般不用作密度梯度離心超速連續(xù)流轉(zhuǎn)頭適合做大容量樣品的等密度離心分離。（三）密度梯度-材料和梯度型式的選用1、 對(duì)于速率-區(qū)帶密度梯度離

12、心，梯心度選擇要點(diǎn)（I） 概述：用速率一區(qū)帶法下簡(jiǎn)移尺R-z法進(jìn)行分離的主要原理是依靠不同樣品在梯度中沉降速率的不同來分離（比化樣品，因此希望樣品在沉降能通過整個(gè)離心管長(zhǎng)度的提高分辨率。作為最基本條件就是梯度液的最大密度必須少于樣品顆粒的密度。用有密度梯度的支持液作R-z離心有以下優(yōu)點(diǎn)：*當(dāng)樣品中不同組份分層進(jìn)入梯度液時(shí)，梯度的較高密度支持著樣品這樣就使樣品各個(gè)不同密度的層次以較窄（或較?。┑膮^(qū)帶沉降從而得到期較高的分辨率（或較高的純度）* 梯度液的密度一般是從離心管上部到底部逐漸增加，這樣就可以穩(wěn)定液栓，提示抗對(duì)和抗機(jī)械擾動(dòng)的能力（接近離心過程結(jié)束時(shí)，純樣品區(qū)帶和它的支持液的密度差較少）*

13、梯度液粘性系數(shù)逐漸增大也使純樣品區(qū)帶變窄從而提示了分辨率而逐漸減緩的沉降速度使同一組份樣品逐漸靠擾，提高了分離純度。（II） 梯度、材料的選用一個(gè)理想的梯液就具備：化學(xué)穩(wěn)定性好；高溶合度；低滲透性；在溶劑中穩(wěn)定性；較低的光吸收特性；價(jià)廉等。遺憾的是很難找到一種適合于各種R-z離心的完美無缺的梯度液。對(duì)于大參數(shù)R-z離心，蔗糖是比較合適的梯度材料。盡管它在高密度（>30% W/N）時(shí)粘性每數(shù)較大，但綜合比較表明它可以廣泛應(yīng)用。但由于蔗糖在各種密度時(shí)（即使是低密度時(shí)也如此）右較高的滲透性，分離一些對(duì)滲透性敏感的生物體組份時(shí)需要選擇其他梯度材料，如由pharmacia公司開發(fā)的Ficoll等等

14、。在大多數(shù)情況下，梯度液的PH值應(yīng)與被分離時(shí)生物樣品的生理PH值一致。對(duì)密度梯度材料的基本要求：a） 能夠配制所需要的密度范圍b） 粘性系數(shù)較低c） 溶合度高d） 有密度與光折射率的對(duì)照資料e） 對(duì)被分離樣品無損害f） 對(duì)被分離樣品滲透很少g） 在離分離完成后很容易與生物樣品分離h） 化學(xué)了性放穩(wěn)定i） 對(duì)離心過程中所接觸的轉(zhuǎn)頭材料，離心管，管蓋及密材料，連續(xù)流及區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的管道等等無腐蝕作用j） 純度高k） 毒性少l） 價(jià)格較低m） 已知該材料的某些物理、化學(xué)、熱力學(xué)性能。常用的梯度材料有：蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、酒石酸鉀、溴化鈉、溴化鉀、碘化鈉、碘化鉀、氯化銫、氯化銣、硫酸銣、三氯（耳苯

15、酸鉤、三氟醋酸銫、右旋糖苷，白蛋白、Ficoll, percoll, mettizamide, Nycodebnz, Ludox, Dextian等等（III） 梯度形狀的選擇：所謂梯度形狀是指梯度介質(zhì)沒著離盡管長(zhǎng)充方向的密度變化特征。用于R-z離心密度梯度常用連續(xù)梯度也變是密度隨著離心本徑的增加而光滑地（不是實(shí)變化）增大，直線型的，光滑曲線型的（一般用凸指數(shù)或凹指數(shù)曲線，或凸凹指數(shù)曲線聯(lián)用的）都屬于連續(xù)梯度。不連續(xù)（階梯型）梯度采用于等密度離心。*線型：在甩平轉(zhuǎn)頭中做R-z離心最常用線性梯度。制各線性梯度時(shí)要注意：（a） 在甩平或垂直轉(zhuǎn)頭中制各線性梯度時(shí)，梯度液西的密度必須足支持樣品，而底部

16、密度必須少于被分離樣品組份的密度。（b） 一般地說較大的梯度斜率可以得到較高分辨率（c） 蔗糖的常用線性梯度范圍是520%W/V或1040%W/V（d） 可以用梯度議制各線性梯度，也可以人工輔設(shè)整個(gè)價(jià)梯型梯度，離心管二靜置一致時(shí)間后也可以形成近線性梯度。*等運(yùn)動(dòng)梯度（等速梯度）（Isokinetic）等運(yùn)動(dòng)梯度是指在某一恒定離心轉(zhuǎn)速時(shí)，樣品顆粒在梯度中以定常速度沉降。在做到等速沉降，必須使梯度和粘性力的增加與沿著離心本徑方向的離心力增加相平衡，在這種梯度液中，顆粒的沉降距離與離心時(shí)間，離必力，以及顆粒本身的沉降多數(shù)成正比。因此如果已知某單一組份樣品的沉降分?jǐn)?shù)，就可以算出在同一梯度中沉降的其他組

17、份的沉降系數(shù)。在甩平轉(zhuǎn)頭中用等速沉降梯度時(shí)，從旋轉(zhuǎn)中心算起的離心距離與沉降系數(shù)的關(guān)系應(yīng)該是線性關(guān)系。為了構(gòu)造等速沉降梯度種慢必須注意到轉(zhuǎn)頭、離心管，梯度合質(zhì)的密度，濃度和粘性系數(shù)在同一溫度。在甩平轉(zhuǎn)頭中作蛋白質(zhì)分離常用520%（W/V）的蔗糖梯度在5攝氏度離心可以達(dá)到近似的等速沉降的效果，而1030%（W/V）的甘油梯度在5攝氏度時(shí)分離DNA或RNA也可以達(dá)到近似等速沉降的目的其他大金數(shù)樣品分離的等速沉降梯度是凸指數(shù)型曲線。*凸型指數(shù)曲線與凹型指數(shù)曲線梯度：為了支持樣品使其中組份在離心開始前不致于沉入梯度，我們常常望梯度曲線在近度面處有較陡的斜率，也就是說在近液面處梯度液的密度沿離心管長(zhǎng)度方向

18、增加得很快。這就是凸指數(shù)曲線梯度，與比相反，如果液面處梯度液足以支持（托住）樣品，故慮到某些樣品在離心管中下部需要較慢的沉降率（在高密度區(qū)）才能得到理想的分辨率，那么凹型指數(shù)曲線型梯度變能滿足這個(gè)要求。*復(fù)合型梯度：如果用程序梯度儀來制備梯度，那么上節(jié)中的凸凹指數(shù)曲線梯度可以復(fù)合在同一梯度液中，這樣的復(fù)合梯度在它們各自的區(qū)域保持了它們各自的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)然也制備其他類型的復(fù)合梯度。一般說，復(fù)合梯度多用于區(qū)帶離心。（2）等密度離心，梯度要素的選擇：（I） 梯度材料及梯度溶液選擇：所有的等密度離心都使用水溶性緩沖劑作溶劑，緩沖劑的組成及PH值取決于生物樣品的性質(zhì)。對(duì)細(xì)胞，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或其他生物大分子的等密

19、度離心分離各有不同要求。常用于等密度離心梯度材料有：材料名稱 DNA RNA 核蛋白 膜 亞細(xì)胞器 細(xì)胞 病毒蔗糖 不適合 不適合 可用 較好 較好 可用 較好Ficoll 不適合 不適合 不適合 可用 可用 最佳 較好CSCL 最佳 較好 最佳 不適合 不適合 不適合 較好Percoll 不適合 不適合 不適合 可用 較好 較好 可用Nycodez 可用 可用 最佳 最佳 最佳 較好 較好從上表可以看出，對(duì)R-z離心蔗糖是很好的梯度材料，而對(duì)于等密度離心，不同的生物樣品對(duì)梯度材料的要求有較大差異。（II） 梯度型式選擇：離心時(shí)，溶液中各種組份都同時(shí)處在離心聲中，被分離的組份及梯度材料的分子都

20、在離心力作用下向離心管底部（甩平、角式）或外壁（垂直管、近垂直管、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、連續(xù)流轉(zhuǎn)頭）沉降。對(duì)于梯度材料，如果它們的沉降速度在離心初始階段遠(yuǎn)大于濃度擴(kuò)散速度，那么就可以形成連續(xù)的密度梯度。這就是"自形成梯度"產(chǎn)生的基本原理。我們可以把被分離樣品和梯度材料混合在一起離心，梯度材料去離心過程中形成密度梯度，而樣品中不同組份則沉降（或上浮）到它們自己的等密度區(qū)。另一種方法是預(yù)先制備好密度梯度，將樣品鋪在離心管（或區(qū)帶轉(zhuǎn)頭）的某一部份（如離心管上部，下部或中部），離心，使樣品中各種組份沉降（或上浮）到它們自己的等密度區(qū)前后，從而達(dá)到了我們所需要的"平衡"結(jié)果。

21、預(yù)先形成梯度可以是不連續(xù)的（階梯型），也可以是連續(xù)梯度。階梯型不連續(xù)梯度大多適用于從植物或動(dòng)物組織的勻漿中分離整細(xì)胞或亞細(xì)胞器，或用于某些病毒的純化。而連續(xù)梯度由于共密度平滑地變化，對(duì)于某些生物樣品的多種成份組合的分離可以得到較低市制分辨率而得到了廣泛的應(yīng)用。選擇自形成梯度還是預(yù)形成梯度，主要取決于材料的性質(zhì)。如果些膠體硅材料可在1000020000xg的離心聲中離心30分鐘就可以自形成梯度（例如美國(guó)Du pont公司的的Ludox及瑞典pharmarcia公司的Percoll）。但對(duì)某一些材料，自形成梯度的時(shí)間很長(zhǎng)，對(duì)離心力的要求也很高。如CSCL或Meterizamide需要去500005

22、00000xg的離心聲中離心數(shù)少時(shí)甚至數(shù)十小時(shí)才能自形成梯度（如用CSCL做質(zhì)粒DNA分離，梯度液中加E.B.和Triton x-100，在490000xg需要離心4小時(shí)，才能利用CSCL的自形成梯度分離出質(zhì)粒DNA，染色體DNA，RNA和蛋白質(zhì)。）預(yù)形成梯度的主要優(yōu)點(diǎn)是離心時(shí)間較短，因?yàn)槲覀冎灰蕬]樣品中某個(gè)組份到達(dá)其等官度區(qū)所需要的時(shí)間。預(yù)形成梯度常被用來分離較大顆粒，如>100S的樣品。預(yù)形成梯度的缺點(diǎn)是*被分離樣品的容量較少（與自形成梯度相比）*對(duì)某些樣品如細(xì)胞或病毒會(huì)因單向沉降而產(chǎn)生顆粒聚結(jié)從而減少了樣品回收率至影響純度。*預(yù)先制備樣度液需較長(zhǎng)時(shí)間，亦較繁復(fù)。與預(yù)形成梯度相比較

23、，自形成梯度有較大樣品容積（特別是使用垂直剖面積較大的垂直管或近垂直離心這個(gè)優(yōu)點(diǎn)更突出）；可以簡(jiǎn)單地高速初始密度；離心過程中樣品既右上浮又右沉降，也就是混在梯度液中的樣品在離心過程中，在梯度材料自形成梯度的同量從離心力的正反二個(gè)方向向自己的等密度區(qū)靠擾，最后排列在自己的等密度區(qū)上下形成純樣品區(qū)帶。從這個(gè)意義上說，樣品是真正到達(dá)了自己的等密度區(qū)而具有很高制純度。自形成梯度的等密度離心又稱均衡等密度離心（Eguilibrim-Isopycnic）（III） 自形成梯度綜上所述，某些梯度材料能夠在離心過程中形成密度梯度，Ludox,Percoll中的膠體硅顆?？梢暂^快地向離心管靠低（如甩平轉(zhuǎn)頭）等或

24、外側(cè)（垂直管轉(zhuǎn)頭）而另一些材料如CSCL，CS2SO4，Metrizamide等則在沉降過程中愛到共反向濃度擴(kuò)散的影響，達(dá)到平衡的時(shí)間就比較長(zhǎng)。平衡后梯度曲線的形狀不僅依賴于梯度材料本身，也取決于其他一些離心條件。自形成梯度的最基本條件是樣品中需要分離的各種組份在分離后都就包含在梯度范圍中。最佳的自形梯度形狀還應(yīng)該使被分離后都處在各自的較窄的純樣品區(qū)帶內(nèi)，只有這樣才能得到較高的分辨率。但很多單一組份在尺寸和密度上都有差異。就使得同種樣品區(qū)帶離心后顯得比較寬。為了提高分辨率變必須使梯度曲線變得陡一些，但要隨心所欲做到這一點(diǎn)都很困難。幸運(yùn)的是對(duì)于所有梯度材料，計(jì)算自形成梯度的公（也就是自形成梯度曲

25、線的形成原理）是一樣的。由于用CSCL分離質(zhì)粒DNA已有近30年歷史，大多數(shù)定量分析工作集中于討論CSCL梯度。用下面的一些公式可以計(jì)算自形成梯度曲線的形狀，可用于設(shè)計(jì)最合適的密度梯度。*梯度曲線的斜率：密度梯度曲線中某一點(diǎn)的最終斜率ds/dr可以用下式計(jì)算：是角度（弧度/秒） ：從旋轉(zhuǎn)中心到計(jì)算點(diǎn)的距離（cm）o：梯度材料的密度梯度比例常數(shù)o的數(shù)值請(qǐng)參考余興明"質(zhì)粒DNA的超速離心分離"或J.B.Martin"Biopolymers"9，1970，P597用這個(gè)公式計(jì)算梯度曲線的中下部占3/4離心管中梯度高度的ds/dr值比較接近實(shí)際情況，對(duì)上部1/4

26、長(zhǎng)度與實(shí)際情況有些差別。從上面公式可以看出，要質(zhì)曲線變陡a：降低ob：提高轉(zhuǎn)速c：加大離心半徑d：增大初始密度以同等轉(zhuǎn)速離心，甩平轉(zhuǎn)頭的r較大，在同等初始密度條件下，甩平轉(zhuǎn)頭的密度梯度曲線比垂直管轉(zhuǎn)頭，近垂直轉(zhuǎn)頭或固定角式轉(zhuǎn)頭都要陡一些。（參見下圖）CSCL初始密度為1.72g/cm3時(shí)的自形成梯度曲線九十年代以前生物大分子離心分離實(shí)驗(yàn)多數(shù)是利用甩平轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)速在60000rpm以下，某些實(shí)驗(yàn)一次要離心數(shù)十小時(shí)，使用的CSCL也較多（分析純，價(jià)格高，且不能反覆使用）離心分離成本昂貴（如80年代初期，質(zhì)粒DNA分離，CSCL初始密度為1.71g/cm3，33000rpm，20攝氏度甩平轉(zhuǎn)頭離心72

27、小時(shí)，一次離心就用去了驅(qū)動(dòng)部1.4億轉(zhuǎn)的的壽命，而當(dāng)時(shí)的超速離心機(jī)驅(qū)動(dòng)部的保用壽命才100億轉(zhuǎn)，雖然由于CSCL去離心后梯度曲線較陡而獲得了很純的質(zhì)粒DNA和染色體DNA，但成本實(shí)在是太高了）。九十年初開始使用近垂直管（或秒少角度管）轉(zhuǎn)頭，在CSCL梯度中加入E.B.和Triton x-100，初始密度1.55g/cm378000rpm，20攝氏度離心4小時(shí)（用去驅(qū)動(dòng)部壽命0.187轉(zhuǎn)）或用垂直錠，同樣的梯度100000rpm，20攝氏度2小時(shí)（用去驅(qū)動(dòng)部壽命0.12億轉(zhuǎn)）都獲得了滿意的結(jié)果。（文獻(xiàn)5）*梯度的密度范圍：在不同距離處（r2,r1）密度差可以用下面公式表示：從上式可以看出（S2-

28、S1）值不得和轉(zhuǎn)速的平方而且和距離的平方差成正比。*轉(zhuǎn)頭選擇對(duì)梯度曲線斜面率與梯度范圍時(shí)影響：從前面的曲線圖可以看出對(duì)不同轉(zhuǎn)頭，梯度曲線的差異：甩平轉(zhuǎn)頭離心時(shí)和復(fù)原（離心完成）后對(duì)于梯度來說，離心管中液面至管底距離保持不變。對(duì)固定角式，小角度轉(zhuǎn)頭及垂直管轉(zhuǎn)頭，離心頭沉降距離很微短，而在離心后復(fù)原時(shí)這項(xiàng)距離明顯拉長(zhǎng)了，也就是說梯度曲線變得平緩了，這種距離的延伸右利于離心分辨率的提示。因此垂直管轉(zhuǎn)頭比NVT（近垂直管）轉(zhuǎn)頭，NVT轉(zhuǎn)頭比角式轉(zhuǎn)頭的距離延伸更大，分辨率也就更高。但與此相反，純樣品帶的寬度都是甩平轉(zhuǎn)頭最窄，垂直管轉(zhuǎn)頭最寬。*梯度中的最大和最少少密度：計(jì)算前，首先要找到等密度點(diǎn)的位置等密

29、度點(diǎn)：離心層密度與率心開始時(shí)初始密度相等的點(diǎn)。對(duì)于甩平轉(zhuǎn)頭：設(shè)等密度點(diǎn)少rc式中 rt：梯度表面與旋轉(zhuǎn)中心距離：rb：離心管底與旋轉(zhuǎn)中心距離該公式可用于估算離心結(jié)束時(shí)（轉(zhuǎn)頭剛開始減速時(shí)）角式轉(zhuǎn)頭及垂直管轉(zhuǎn)頭的rc位置。設(shè)梯度液初始密度（均勻）為Si，在求得rc后梯度中最大密度與最少密度可用下式計(jì)算：如果已經(jīng)設(shè)計(jì)好密度變化范圍就可以計(jì)算所需要的離心轉(zhuǎn)速：* 計(jì)算實(shí)例DNA分離，CSCL梯度，初始密度1.70g/cm3，根據(jù)離心要求，理想的最大密度為Sb=1.75 g/cm3最少密度為St=1.65 g/cm3用某甩平轉(zhuǎn)頭最高轉(zhuǎn)速55000rpm，rb=12cm，rt=6.7cm則N=45500r

30、pm，校核：由于密度>1.2 g/cm3按規(guī)定這個(gè)轉(zhuǎn)頭的最高轉(zhuǎn)速不能超過：=46200rpm46200rpm>45500rpm所以，以上設(shè)計(jì)成立。* 離心時(shí)間計(jì)算：計(jì)算例題中離心所需要的時(shí)間：已知r平均=9.35cm，樣品S20，w=15* 討論必須注意不能使CSCL在離心管底部最大密度超過1.90 g/cm3120oC）否則CSCL將可能析出結(jié)晶，而CSCL的結(jié)晶密度為4 g/cm3，很可能在結(jié)晶的局部損壞塑料離心管，從而造成CSCL泄漏而進(jìn)一步腐蝕轉(zhuǎn)頭，（特別是鋁合金轉(zhuǎn)頭）而造成轉(zhuǎn)頭在離心中炸裂的嚴(yán)重事故。為安全起見，生金屬的梯度實(shí)驗(yàn)不要去鋁合金轉(zhuǎn)頭或甩平轉(zhuǎn)頭中的鋁合金吊桶中做。（IV） 預(yù)形成梯度：* 不連續(xù)（階梯形）梯度：分層鋪設(shè)不連續(xù)梯度，樣品鋪在梯度液之上，離心時(shí)不同組份越過少于本身浮密度時(shí)梯度層次而最后達(dá)密度樣品浮密度的梯度界面之前形成純樣品區(qū)帶。一般設(shè)置三至五個(gè)層次。* 連續(xù)梯度根據(jù)