超濾法提取大蒜超氧化物歧化酶的工藝研究

1、超濾法提取大蒜超氧化物歧化酶的工藝研究王晶冰1,劉建國1,崔占峰2(1.中國石油大學生物工程與技術中心,山東青島266555;2.英國牛津大學組織工程與生物工程中心,牛津英國摘要:在熱處理除去部分雜蛋白的基礎上,利用相對分子質量為5×104的聚醚砜膜對大蒜超氧化物歧化酶(S OD 進行了分離和純化,考察了蛋白質溶液性質(pH 、離子強度和溶液流體力學性質(流速、攪拌速率對S OD 透過率的影響。在最優(yōu)分離條件下,S OD 純度可高達9016%,比活性為712149U/mg 。關鍵詞:超濾;蛋白分離;超氧化物歧化酶;大蒜中圖分類號:T Q028153文獻標識碼:A 文章編號:0253-

2、4320(2009S1-0320-03Isolation and puri fication of superoxide dismutase from garlic with ultrafiltrationWANG Jing 2bing 1,LIU Jian 2guo 1,CUI Zhan 2feng 2(1.Center for Bioengineering and Biotechnology ,China University of Petroleum ,Qingdao 266555,China ;2.Department of Engineering Science ,Universit

3、y of Ox ford ,Ox ford OX 13P J ,UK Abstract :The separation and purification of superoxide dismutase (S OD from garlic is studied with ultrafiltration using 50kDa polyethersulfone membrane.The effects of s olution pH and ionic strength on the transmission of S OD and the im purity protein (closer m

4、olecular weight to S OD are quantified using the pulsed sam ple injection technique.Other effects including stirring speed and permeate flux on separation of S OD are als o studied using parameter scanning ultrafiltration.Under the optimized conditions ,the purity of S OD obtained can reach higher t

5、han 9016%with an activity of 712149U/mg.K ey w ords :ultrafiltration ;protein fractionation ;superoxide dismutase ;garlic收稿日期:2009-07-19作者簡介:王晶冰(1981-,女,博士生;劉建國(1962-,男,博士,教授,主要研究領域為生物加工及組織工程,通訊聯(lián)系人,0532-*,超氧化物歧化酶(S OD 是一種能夠催化超氧負離子發(fā)生歧化反應的金屬酶1,也是生物體抵御活性氧毒害作用的第一道防線,具有抗輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤和癌癥等功能,在保健品、醫(yī)藥、化妝品等行

6、業(yè)中具有重要的應用價值2。目前所用的S OD 大部分都是從動物血液中提取的,由于成本和動物免疫等方面的原因,人們轉而研究如何從植物中提取S OD 。大蒜是目前已知的S OD 含量較高的植物之一,從中分離提取S OD 具有較高的研究價值。從大蒜中提取超氧化物歧化酶(S OD 多采用分步鹽析法3、有機溶劑沉淀法4等傳統(tǒng)分離技術。超濾作為一種新型生化分離技術,具有操作條件溫和,無相變,無需添加化學試劑,且易于實現(xiàn)自動化控制,節(jié)約能源等優(yōu)點5,已廣泛應用于各種生物大分子的濃縮、分離和純化。本論文在熱處理的基礎上獲得大蒜S OD 粗酶液,利用載相超濾技術和參數(shù)掃描超濾技術系統(tǒng)考察了膜分離工藝參數(shù)對S O

7、D 透過率的影響,實現(xiàn)了超濾分離大蒜S OD 過程。1實驗部分111粗酶液制備挑選無霉斑無黃褐斑點的去皮大蒜,稱重后加入2倍質量的磷酸鹽緩沖溶液,利用組織搗碎機(IK A ,8010S 搗碎1min ,將溶液在60下恒溫加熱20min ,使熱不穩(wěn)定性蛋白質變性,以沉淀形式析出;將上述溶液在4、10000r/min 下離心15min ,棄去沉淀,上清液即為大蒜S OD 粗酶液。112超濾提取工藝優(yōu)化利用載相超濾技術和參數(shù)掃描超濾技術6,對大蒜S OD 膜分離過程的工藝參數(shù)進行系統(tǒng)優(yōu)化,實驗所用的超濾膜為Millipore 公司銷售的相對分子質023Sep.2009現(xiàn)代化工第29卷增刊(1M od

8、ern Chemical Industry 2009年9月量為5×104的聚醚砜膜,實驗裝置和實驗過程參見文獻7。用作對比的傳統(tǒng)分離方法選用硫酸銨沉淀法3。113蛋白質分析使用快速蛋白液相系統(tǒng)(FP LC對S OD粗酶液、膜分離過程的濾出液和截留液的組成進行凝膠色譜分析(Superose610/300G L。采用鄰苯三酚自氧化法測定S OD活性8,1單位的S OD活性定義為抑制鄰苯三酚氧化速率到50%的酶的量;利用紫外光吸收法測定溶液總蛋白質含量9;采用凝膠色譜法確定蛋白質分子質量。2結果與討論211工藝優(yōu)化如圖1(a所示,粗酶液中主要含有6種蛋白質,通過硫酸銨沉淀法確定目標蛋白質為

9、截留體積為17171m L左右的峰,如圖1(b所示,記為S OD,選取相對分子質量與S OD最接近、且含量對S OD純度影響大的雜蛋白(記為IPA作為參比對象,考察分離條件對S OD和IPA透過率的影響。透過率(S a定義為蛋白質在濾出液中的濃度(C p和其在原料液中的濃度(C b之比,即S a=C p/C b。21111pH當粗酶液pH高于815或者低于415時即產生沉淀,因此選擇pH=510810作為遴選范圍。每隔015個pH單位測定該條件下S OD和IPA的透過率 。(a 粗酶液(b鹽析法提取S OD樣品圖1凝膠色譜譜圖比較實驗結果表明,緩沖溶液的pH對S OD的表觀透過率有較大影響。當

10、pH由510增至810,S OD的表觀透過率先增大,在pH610時達到最大值,然后到pH 615的過程中降低,在pH710時出現(xiàn)第二個極大值。S OD的最大透過率出現(xiàn)在pH610附近(約6114%,最小透過率出現(xiàn)在pH715左右(約2190%。IPA 在pH510715的透過率與S OD趨勢相同,在pH 810處獲得最大值。因此這個過程的最大選擇性(=S a_S OD/S a_IPA發(fā)生在pH810。表1不同分離條件下SOD和IPA的透過率21112離子強度鹽濃度能改變蛋白質分子間的靜電引力,是影響蛋白質選擇性透過超濾膜的主要因素之一。分別在溶液中在存在0、50、100、150、200mm o

11、l/L NaCl條件下測定S OD和IPA的透過率。在鹽濃度達到200 mm ol/L之前,S OD的透過率隨鹽濃度的升高而增大。隨著NaCl濃度繼續(xù)增大,S OD透過率略有下降。當NaCl濃度從0mm ol/L增加到50mm ol/L時,IPA的透過率逐漸下降,這可能與IPA的結構改變有關。當鹽濃度從50mm ol/L增至200mm ol/L時, IPA透過率的變化趨勢與S OD相似。因此,不加Na2 Cl適合S OD的分離和提純。21113流速分別在1313、2615、3918、5311L/(m2h的載相流速下分離粗酶液,綜合透過率差異、分離效率和體系壓力帶來的膜污染等因素,當流速從131

12、31232009年9月王晶冰等:超濾法提取大蒜超氧化物歧化酶的工藝研究L/(m 2h 增至5311L/(m 2h 時,S OD 和IPA 的透過率迅速降低。另外,跨膜壓隨流速增加而增強,膜污染也更嚴重。因此,流速為2615L/(m 2h 時適合S OD 的分離和提純。21114攪拌速率超濾時攪拌速率對蛋白質的分離有很大影響,因為它能影響蛋白質的濃差極化和質量傳遞系數(shù)。分別在0、300、600、900、1000、1200r/min 轉速下分離粗酶液,當攪拌速率從0r/min 增至1200r/min 時,S OD 和IPA 的透過率都降低,在1500r/min 時,S OD 的透過率比1200r/

13、min 時的大,而IPA 的透過率比1200r/min 時的小。綜合考慮各影響因素,在1200r/min 下具有較好的綜合分離效應。212蛋白質分析在最優(yōu)操作條件下超濾4h 獲得的大蒜S OD 的凝膠色譜譜圖如圖2所示,絕大多數(shù)IPA 已被去除。結合電泳染色結果,可確定該S OD 比市售的標準S OD (牛血清S OD 和山葵S OD ,Sigma 略小,亞基相對分子質量為 1315×103,相對分子質量為 27×103。圖2大蒜S OD 凝膠色譜譜圖:牛血清S OD ;:山葵S OD ;:大蒜S OD圖3電泳染色結果表2顯示了使用超濾法提取所獲的S OD 與硫酸銨沉淀法所

14、獲產品的性質差異,超濾法提取的S OD 活性較傳統(tǒng)法略高,但S OD 的純度、回收率和純化倍數(shù)均較硫酸銨沉淀法提取的S OD 有很大提高。表2不同方法提取的SOD 性質比較方法比活性/U mg -1純化倍數(shù)產品回收率/%純度/%71214910132891749016注:分離條件:相對分子質量為5×104的聚醚砜膜,pH 810,無NaCl ,載相流速2615L/(m 2h ,攪拌速率1200r/m in 。3結語利用相對分子質量為5×104的聚醚砜膜超濾分離大蒜S OD ,步驟簡單,成本低廉,操作條件溫和,分離過程無化學添加,不產生化學污染,易于批量生產,具有良好的應用前

15、景。使用載相超濾分離大蒜S OD 的最佳條件為:pH 810,溶液中無NaCl ,載相流速2615L/(m 2h ,攪拌速率1200r/min 。在此條件下,S OD 純度可達9016%,活性為712149U/mg 。參考文獻1M cC ord J M ,Fridovich I.Superoxide dismutase :An enzymatic functionfor erythrocuprein (hem ocuprein J .J Biol Chem ,1969,244:6049-6055.2Reddi A R ,Jensen L T ,Naranuntarat A ,et al .Th

16、e overlapping roles ofmananese and Cu/Zn S OD in oxidative stress protection J .Free Rad Biol M ed ,2009,46:154-162.3孫永君.大蒜中S OD 的提取研究J .化學與生物工程,2005(10:23-25.4He N ,Li Q B ,Sun D H ,et al .Is olation ,purification and charactevizationof superoxide dismutase from garlic J .Biochem Eng J ,2008,38:33-38.5G hosh R.Protein bioseparation using ultrafiltrationC.Canada :Im perialC ollege Press ,2005:15-16.6G hosh R.Fractionation of biological macrom olecules using carrier phaseultrafiltrationJ .Biotechnol Bioen ,2001,74(1:1-11.7Liu J G,Lu J R ,Zhao X B ,et al .Separation of glucose