人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定

1、人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定作者：秦明春，王若光，秦莉花，劉小麗，李春梅，劉惠萍，葉贊【摘要】目的探討人臍靜脈內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)方法，提高體外分離培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞的成功率。建立血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)模型，為體外研究血管內(nèi)皮細胞提供實驗基礎(chǔ)。方法取2根臍帶（至少20cm）沖凈淤血，采用加工穿刺針固定臍靜脈灌注消化液,一根用0.2膠原酶，另一根用0.1膠原酶和0.25胰酶等比混合消化液，比較兩種酶的消化效果。收集細胞并用含有10ng/mL的VEGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察細胞的生長及傳代。并在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學(xué)特點，同時用免疫組織化學(xué)的方法對所得細胞進行鑒定。用流式細胞術(shù)觀察細胞周期。結(jié)果

2、兩種消化酶方法均獲得了相當數(shù)量的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，膠原酶的消化效果稍優(yōu)于混合消化酶，且比較理想的消化時間均為13min，細胞接種后45h開始貼壁生長，1周左右可生長成單層，光鏡下呈多角形，“鋪路石”樣排列，免疫組織化學(xué)法可見內(nèi)皮細胞胞漿中人第因子相關(guān)抗原呈陽性反應(yīng)。細胞周期顯示約有50.6%的細胞處于G0/G1期。結(jié)論膠原酶和膠原酶與胰酶等比混合消化液灌注法是獲得臍靜脈內(nèi)皮細胞的一種可取方法，而膠原酶是分離培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞的首選消化液，成功率高，可靠性大，可成功構(gòu)建體外研究血管內(nèi)皮細胞的模型?！娟P(guān)鍵詞】人臍靜脈內(nèi)皮細胞；細胞培養(yǎng)；流式細胞術(shù)；細胞周期；分離；鑒定Cultivationandi

3、nvitroidentificationofendothelialcellsfromhumanumbilicalveinToexploretheprimaryculturemethodofhumanvascularendothelialcells(ECs)fromumbilicalvein,enhancethesuccessrateofseparatingandculturingECsinvitro,establishthemodelofhumanvascularECs,andprovideanexperimentalmethodforresearchofECs.MethodsTheumbil

4、icalveinsinhumanumbilicalcords,20cmlong,werefixedandfilledthedigestivefluids,0.2%collagenenaseinonecordandthecomplexenzymeof0.25%trypsinand0.1%collagenaseinanother,andthedigestiveresultswerecompared.Allthecellswerecollectedandculturedinfluidwith10mg/mLVEGF,theirprocreationandgenerationwereobserved,t

5、hemorphologiccharacteristicsofECswereobservedwithlightmicroscopyandimmunohistochemistryunderinvertedmicroscope,andthecellcyclewasobservedbyflowcytometer.ResultsEnoughECswereobtainedfrombothdigestiveliquids,andcollagenenasewasbetterthancomplexenzyme,theeffectivedigestingtimewas13minutes.theculturingc

6、ellsgrewonthewallappearedafter4-5hoursandthemonolayercellswereformedafteroneweek.factorintheECsshowedpositivereactionbyimmunohistochemistry.Cellcyclerevealedthat50.6%cellswereatstageofG0/G1.ConclusionTheperfusionwithcollahumanvascularendothelialcellinumbilicalvein;cellculture;flowcytometry;cellcycle

7、;separation;identification血管內(nèi)皮細胞是位于血管內(nèi)壁的單層細胞，通過產(chǎn)生和分泌許多血管活性物質(zhì)，在維持血管舒縮、抗凝血及血管構(gòu)建等方面起重要作用，同時由于其特殊的解剖學(xué)部位使內(nèi)皮細胞能敏感地感知血流、壓力、炎癥信號以及血液循環(huán)中激素水平的變化，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與鄰近及遠處的細胞相互聯(lián)系，對各種刺激作出反應(yīng)，維持機體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定。內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)是研究內(nèi)皮細胞生物學(xué)與多種疾病關(guān)系的重要方法。新生兒臍帶由于取材方便，來源充足，而成為血管內(nèi)皮細胞體外實驗的主要材料。本文利用健康產(chǎn)婦正常娩出的胎盤端游離臍帶，采用改進的灌注消化法，運用不同的消化酶成功分離了人臍靜脈

8、內(nèi)皮細胞，并用免疫組織化學(xué)法進行了鑒定，從而為構(gòu)建體外研究血管內(nèi)皮細胞的模型及進一步實驗研究打下了基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.2方法2結(jié)果2.1人臍靜脈內(nèi)皮細胞的形態(tài)學(xué)觀察相差倒置顯微鏡下觀察，人臍靜脈內(nèi)皮細胞貼壁單層生長，呈短梭狀或鋪路石樣鑲嵌排列，細胞為扁平多角形，邊界清楚，胞漿豐富（見圖1-B、C）。胞核清晰可見，為圓形或橢圓形。原代培養(yǎng)細胞，于接種后2h開始貼壁生長（見圖1-A），傳代細胞約0.5h后即開始貼壁生長。原代細胞1周左右可長滿，傳代細胞生長旺盛，有時可見多核細胞。2.2因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細胞因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)染色可見細胞呈圓形、梭形或多邊形，

9、胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒（見圖1-D），核周密集，而對照組內(nèi)未見著色。證實培養(yǎng)的細胞為內(nèi)皮細胞。2.3流式細胞術(shù)檢測人臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞周期結(jié)果顯示S期的細胞約有36.5%，S+G2+M期的細胞約有47.6%活躍于增殖期，而處于G0/G1期的細胞約占有50.6%左右（見圖2），臺盼藍排除實驗示活細胞的百分比為94.5%，換3個視野算平均值為92.3%。3討論新生兒臍帶來源充足，取材、操作方便可行。且臍靜脈在許多方面具有與動脈相似的生物學(xué)特性。因而，臍靜脈內(nèi)皮細胞成為血管內(nèi)皮細胞體外實驗的主要材料。成功地獲得大量臍靜脈內(nèi)皮細胞，是體外建立血管內(nèi)皮細胞模型的保證。在培養(yǎng)細胞的獲取上，多采用機械刮取法

10、和酶消化法。機械刮取法是將臍靜脈剪開，用手術(shù)刀背等刮取內(nèi)皮細胞或使用帶有尼龍篩的分離管1，但這一方法很難掌握力度，易損傷內(nèi)皮細胞，而且多混有其它細胞如成纖維細胞等?，F(xiàn)多采用酶消化法，胰蛋白酶、膠原酶均可作為消化血管內(nèi)皮細胞的酶，但膠原酶的性較溫和，效果較好。尤其膠原酶可認為是消化臍靜脈內(nèi)皮細胞的理想酶2，價格較昂貴。胰蛋白酶價廉，但對細胞有毒性作用。在本實驗中我們選用膠原酶和膠原酶與胰蛋白酶等比混和消化液，消化13min，均成功獲取了足夠量的血管內(nèi)皮細胞，但膠原酶獲取的細胞數(shù)量要稍多于混合消化液，不過混合消化酶也不失為一種可取的消化液。因此選用合理的消化酶并掌握好消化時間，是成功獲取內(nèi)皮細胞的

11、關(guān)鍵之一。同時，標本材料的新鮮程度也影響獲得內(nèi)皮細胞的數(shù)量。有研究表明3，臍靜脈內(nèi)皮細胞離體后，隨著時間的延長，細胞內(nèi)一些物質(zhì)的含量會發(fā)生變化，如離體超過6h，內(nèi)皮細胞第因子相關(guān)抗原釋放量以及前列環(huán)素生長量均隨著存放時間的延長而呈下降趨勢，時間超過12h后，細胞會出現(xiàn)水腫、變性，活力下降，甚至無法存活。還有研究表明4，臍帶離體3h內(nèi)內(nèi)皮細胞存活率為90%，離體24h后僅有50%存活。本試驗于1h內(nèi)進行消化和原代分離培養(yǎng)，細胞數(shù)量多增殖良好。培養(yǎng)基的pH值也是影響細胞生長的因素之一。內(nèi)皮細胞生長最適pH7.27.4，起初可稍低（7.0左右），這樣易于貼壁生長。提前用多聚賴氨酸預(yù)包被培養(yǎng)瓶也有助于

12、細胞的貼壁。細胞營養(yǎng)液血清的選擇也是決定血管內(nèi)皮細胞能否存活的決定因素。高質(zhì)量的各種血清均能保證內(nèi)皮細胞的正常生長，有試驗結(jié)果顯示5-6：高質(zhì)量的胎牛血清對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的生長有良好的促進作用，是體外成功培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞的關(guān)鍵。我們在實驗中選用類標準胎牛血清，細胞生長良好。人臍靜脈內(nèi)皮細胞體外生長能力較差，增殖緩慢，原代培養(yǎng)不易成功，傳代培養(yǎng)也只能傳34代，在內(nèi)皮細胞培養(yǎng)過程中加入適量的生長刺激因子，這些因子有高效特異的促有絲分裂作用，可明顯促進細胞生長7。我們在總結(jié)失敗經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，在完全培養(yǎng)液中加入10ng/mL的VEGF，成功傳代8代后，細胞仍然生長良好。人臍靜脈內(nèi)皮細胞相對其

13、他血管內(nèi)皮易分離取得，經(jīng)濟實用，成功獲取大量的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，為體外研究建立血管內(nèi)皮提供實驗?zāi)Ｐ?，為進一步研究血管內(nèi)皮的生物學(xué)特性及其與各種疾病的關(guān)系打下基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I】1PiebeM,PaulsenF,JalnkeT,etal.MechanicalbrushcatheterabrasionmethodfortheisclationandcrltureofhumanconbilicalveirendothelialcellsJ.Firstinvitroresults，2001，173(10):955-958.2張小燕,梁朝,趙林,等.人臍靜脈內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)的改進及其鑒定J.中華醫(yī)學(xué)研究雜

14、志，2005,5(6):386.3王建氏,劉萌秋,賴西南.正常臍靜脈離體后不同時期內(nèi)某些物質(zhì)含量的變化J.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,1995,17(1)：86.4程滿根.血管內(nèi)皮細胞單克隆抗體研究J.國外醫(yī)學(xué)生理病理科學(xué)與臨床分冊，1989,10(3):138-141.5徐燕,訾自強,蘇琦華,等.人臍靜脈內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)與鑒定J.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000,6(4):374.6王立巖,佟曉紅,宮桂蘭,等.人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)、鑒定及形態(tài)學(xué)觀察J.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000,26(1):28.7DuXL,SuiGz,StocklauserFK,etal.Inductionofapoptosisbyhighproinsulinandglucoseinculturedhumanumbilicalveinendothelialcellsismediatedbyr