壇紫菜藻膽蛋白及葉綠素a的測定與分析

1、第13卷 第3期2008年7月集美大學學報(自然科學版)JournalofJimeiUniversity(NaturalScience)Vol 13 No.3Ju.l2008文章編號1007-7405(2008)03-0221-06壇紫菜藻膽蛋白及葉綠素a的測定與分析史修周,徐 燕,梁 艷,謝潮添1111,2,3,紀德華1,2,3,陳昌生1,2,3,柳佩娟,王鳳霞11(1.集美大學水產(chǎn)學院,福建廈門361021;2.福建省高校水產(chǎn)科學技術與食品安全重點實驗室,福建廈門361021;3.集美大學水產(chǎn)生物技術研究所,福建廈門361021)摘要研究了不同色澤壇紫菜在不同培養(yǎng)溫度條件下含藻膽蛋白及其葉

2、綠素a量的差異,以及樣品前處理過程中各因素(研磨、光照、被測定藻體的量等)對測定結果的影響.實驗結果表明:1)不同色澤的壇紫菜葉狀體在正常培養(yǎng)條件下,含藻膽蛋白和葉綠素a的量各不相同,其中褐紅色型藻體的藻膽蛋白和葉綠素a的質量比最高,分別達114 87mg/g和8 83mg/g;綠色型藻體的藻膽蛋白的質量比最低(55 39mg/g);桔紅色型藻體的葉綠素a的質量比最低(4 58mg/g).2)不同溫度下培養(yǎng)的壇紫菜,其43)種色素的含量存在一定的差異.在本實驗條件下,隨著培養(yǎng)溫度的升高,壇紫菜色素含量也隨之增加.在影響測定結果的各因素中,對壇紫菜4種色素含量的測定結果影響最大的是研磨,其次為光

3、照.關鍵詞壇紫菜;藻膽蛋白;葉綠素a;測定中圖分類號S968 4文獻標志碼A0 引言壇紫菜(Porphyrahaitanensis)屬暖溫帶性海藻,在我國東南沿海均有分布,是優(yōu)良海藻栽培品種之一.但近年來壇紫菜種質退化、品質下降,造成生長期縮短、病害嚴重、產(chǎn)量降低.因此,選育高產(chǎn)、抗病、耐高溫的紫菜新品種已成為亟待解決的問題.藻膽蛋白和葉綠素含量是紫菜品質選育方面的重要指標之一.藻膽蛋白是紅藻、藍藻和某些甲藻中的一類特有的光合作用天然色素,可分2為藻紅蛋白(PE)、藻藍蛋白(PC)、別藻藍蛋白(APC)三大類.藻膽蛋白具有很高的開發(fā)利用價值,既可以作為天然色素用于食品、化妝品、染料等工業(yè),也可

4、以制成熒光試劑,用于臨床醫(yī)學診斷和免疫化學及生物醫(yī)學等領域31.葉綠素則是一類不穩(wěn)定的化合物,葉綠素含量不僅與生長速度4有很大關系,并且干紫菜中葉綠素含量的多少與感官測定紫菜優(yōu)劣最為一致.細胞的葉綠素含量隨種類和類群而有所不同,同時還受年齡、生長率、光照和營養(yǎng)條件的影響.自20世紀中葉發(fā)現(xiàn)3藻膽蛋白以來,國內(nèi)外學者對藻膽蛋白的性質和化學組成進行了大量的研究,而且對于海藻不同生長階段藻膽蛋白的含量6-75以及氮源8-10、光照11-12對藻膽蛋白含量的影響進行了研究.但是,不同色澤紫菜品質的比較研究以及在實驗過程中各測定條件對藻膽蛋白和葉綠素a測定結果的影響,報道甚少.本實驗旨在了解不同色澤壇紫

5、菜在不同培養(yǎng)條件下的藻膽蛋白及其葉綠素a含量的差異,以及測定過程中各因素對測定結果的影響,從而為壇紫菜優(yōu)良品種的選育提供品質方面的指標.1 材料與方法1 1 材料各種不同品系的壇紫菜由集美大學水產(chǎn)學院壇紫菜種質改良及應用實驗室提供,挑選藻體完整, 收稿日期2007-10-09 修回日期2007-11-10基金項目國家海洋863資助項目(2006AA10A413);國家自然科學基金資助項目(40676077);福建省科技重大專項資助項目(2005NZ1025)作者簡介史修周(1982 ),男,碩士生,從事紫菜生物學研究.通訊作者:陳昌生(1957 ),男,教授,l222 集美大學學報(自然科學版

6、)第13卷顏色正常,有光澤、彈性好的生長盛期藻體.1 2 不同色澤藻體的培養(yǎng)從褐紅色、紫色、紅色、桔紅色、綠色5種不同色澤的藻體幼苗中挑選長度為35cm、完整健康的藻體進行充氣培養(yǎng),實驗室內(nèi)溫度維持在(20 1) ,并定期更換培養(yǎng)液.待藻體生長至長度為4080cm時,陰干后冷凍收藏備用.1 3 不同溫度條件藻體的培養(yǎng)本溫度實驗設定了26、27、28、29、30 共5個高溫實驗組和1個對照組(21 ),實驗藻體包括品系Z-17的F3、Z-26的F3、Z-61的F3、Z-81的F34個不同品系.挑選完整健康的實驗藻體(35cm)放入錐形瓶中,在不同溫度的光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng).光周期為12L 12D

7、,光強為12001400lx.培養(yǎng)期間每天觀察記錄葉狀體生長狀況和潰爛程度,搖動培養(yǎng)液2次以使其混合均勻.每組藻體培養(yǎng)10d,藻體陰干后冷凍收藏備用.1 4 藻膽蛋白與葉綠素a含量的測定藻膽蛋白的測定方法參照文獻13,略有改動.從冰箱中取出冷凍的藻體,稱23g,用適量蒸餾水快速洗滌3遍,平鋪在干凈干燥的紗布上約13層,在風扇前吹干或在空調室陰干,放在粉碎器中,間歇粉碎至粉末狀.精確稱取0 010g和0 030g各1份,放在研磨管中,加入適量的0 05mol/L磷酸鈉緩沖液浸泡約3min,研磨至充分,倒入50mL燒杯中,用緩沖液沖洗研磨管3次以上,燒杯中液體總體積約為20mL,蓋上鋁箔蓋子,放入

8、冰箱冷凍(-20 ),然后室溫避光解凍,如此反復凍融6次,將提取液用300目篩絹網(wǎng)過濾至50mL離心管中,濾液于4 、10000r/min離心20min,取上清液,定容至50mL,搖勻后分別于565、615、650nm波長下測定其OD值.葉綠素a含量的測定方法參照文獻14,略有改動.粉碎冰凍藻體的處理方法與測定藻膽蛋白的一致,然后精確稱取0 010g和0 030g各1份,放在研磨管中,加入適量的90%的丙酮水溶液浸泡約3min,研磨至充分(研磨過程應避免強光照射),倒入40mL的棕色磨口瓶中,用90%的丙酮水溶液沖洗和研磨,蓋上瓶蓋,將棕色磨口瓶放在避光的地方室溫提取葉綠素24h.提取液用30

9、0目篩絹網(wǎng)過濾至50mL離心管中,濾液于4 、10000r/min離心20min,取上清液,測定其體積,搖勻后分別于666、730nm波長下測定其OD值.1 5 陰干藻體烘干質量的測定稱取陰干藻體0 100g,放入培養(yǎng)皿中于105 烘干3h,溫度稍降后即稱其質量(防止吸潮).1 6 不同前處理條件藻膽蛋白與葉綠素a含量的測定1)研磨與粉碎.在對實驗藻體進行處理時,一組進行研磨,另一組進行粉碎,其他實驗條件均相同,分別進行藻膽蛋白與葉綠素a含量的測定.2)黑暗與光照.在藻膽蛋白和葉綠素a的提取過程中,一組避光(黑暗),另一組在3000lx光照條件下提取,其他實驗條件均相同,分別進行藻膽蛋白與葉綠

10、素a含量的測定.3)被測藻體的質量.被測藻體質量分別為0 010、0 030、0 050g.其他實驗條件均相同,分別進行藻膽蛋白與葉綠素a含量的測定.4)凍融次數(shù).實驗藻體研磨后,一組不凍融,放在4 冰箱中提取;一組凍融3次;一組凍融6次.其他實驗條件均相同,然后分別進行藻膽蛋白含量的測定.5)研磨溫度.在對實驗藻體進行研磨時,一組在室溫條件下研磨,一組用4 的冷水保持低溫條件研磨.其他實驗條件均相同,然后分別進行藻膽蛋白含量的測定.1 7 數(shù)據(jù)的計算與處理藻膽蛋白和葉綠素a含量的計算參照文獻7,14的公式計算;數(shù)據(jù)處理用SPSS13 0的單因素方差分析(one wayanova)和t tes

11、t進行統(tǒng)計分析.第3期史修周,等:壇紫菜藻膽蛋白及葉綠素a的測定與分析 223 2 結果2 1 不同色澤藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量的差異如圖1、圖2所示,不同色澤的壇紫菜藻膽蛋白和葉綠素a的含量差異較大.在所進行測定的5種不同色澤的壇紫菜中,褐紅色型壇紫菜的藻膽蛋白和葉綠素a的質量比均為最高,分別達到114 87mg/g和8 83mg/g;紫色型的藻膽蛋白的質量比高達108 05mg/g,但是葉綠素a的質量比卻較低(4 64mg/g);桔紅色型藻體的藻膽蛋白和葉綠素a的質量比均比較低,分別為59 81mg/g和4 58mg/g;綠色型的藻膽蛋白的質量比最低(55 39mg/g).統(tǒng)計分析表明

12、桔紅色和綠色藻膽蛋白的質量比差異顯著(P0 05),其余色澤間差異極顯著(P0 01).2 2 不同培養(yǎng)溫度對藻體色素含量的影響在不同溫度的培養(yǎng)實驗中,隨著溫度升高藻體容易出現(xiàn)潰爛.在28、29 培養(yǎng)的藻體顏色明顯變淡,生長緩慢或者不生長.在4個不同品系的溫度實驗中,除Z-26的F3外,對照組藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量均低于高溫培養(yǎng)條件下生長的藻體.除Z-17的F3的27 實驗組外,各高溫實驗組藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量隨著溫度升高而增加(見表1).表1 不同溫度培養(yǎng)的壇紫菜各品系4種主要色素的含量Tab 1 ThecontentoffourmainpigmentsinP haitanen

13、sisofdifferentstrainsatdifferenttemperatures(mg g-1)品系溫度/ 藻紅蛋白藻藍蛋白別藻藍蛋白藻膽蛋白葉綠素a2124.14 1.52114.55 1.37110.52 1.55449.21 4.4354.74 0.016*2639.31 1.56320.44 0.99716.77 0.75076.52 3.2825.10 0.052*Z-17F32738.11 0.23018.66 0.44615.94 1.03672.72 1.513*4.96 0.073*2845.95 2.81420.93 1.72416.98 1.60983.87 6.

14、137*6.41 0.157*2134.46 0.90417.72 0.75711.16 1.15763.35 0.5116.82 0.211*2628.89 0.43916.04 0.94311.98 2.36756.91 1.4445.61 0.338*Z-26F32735.85 0.76617.22 0.44514.49 3.13067.56 2.443*5.95 0.214*2841.64 1.29616.68 0.53210.72 0.70369.04 1.145*6.03 0.077*2122.34 0.99715.55 0.53910.44 0.43548.34 1.2024.6

15、7 0.143*2626.21 6.26417.42 4.95811.79 3.41155.42 0.2225.58 0.054*Z-81F32728.75 2.03816.57 1.53110.62 0.97455.94 4.450*5.87 0.103*2831.16 1.71916.89 1.48112.49 0.48360.54 3.950*5.00 0.052*2130.43 2.69614.42 0.89410.88 0.83755.73 4.3026.23 0.107*2637.81 4.98916.62 3.09711.24 1.44865.67 9.4996.71 0.272

16、*Z-61F32747.24 0.88220.11 0.50814.89 0.27882.23 1.137*7.17 0.117*2848.24 1.10117.54 0.49913.13 0.5916.42 0.21678.92 0.432*說明:*為差異顯著(P0.05),*為差異極顯著(P0.01).2 3 不同前處理條件對藻膽蛋白和葉綠素a含量測定結果的影響.224集美大學學報(自然科學版)第13卷紫色型和桔色型藻體的總藻膽蛋白含量分別是經(jīng)過粉碎的3 8倍和2 4倍.經(jīng)過研磨藻體的葉綠素a的質量比測定結果分別是經(jīng)過粉碎的10 4倍和11 9倍(見表2).2)光照與黑暗.采取避光措施的紫

17、色型和桔色型藻體的藻膽蛋白的質量比分別比在3000lx光照條件下提取的高24 9%和26 6%.而光照對葉綠素a測定結果的影響更大.在光照條件下提取的紫色型和桔色型藻體的葉綠素a的質量比測定結果分別為0 48mg/g和2 04mg/g;而在鋁箔包裹的棕色瓶中提取的藻體,葉綠素a的質量比分別達到4 82mg/g和5 47mg/g,分別是光照下提取的10 0倍和2 7倍(見表2).表2 研磨及光照對4種色素測定結果的影響Tab 2 Effectsofgrindandilluminationontheresultsoffourpigmentcontent處理條件研磨粉碎紫色型光照避光研磨粉碎光照避光

18、品系藻紅蛋白19.23 0.45767.06 0.69353.42 0.14567.06 0.69314.50.39.50.86 03 59 030.0.0.0.030140274140藻藍蛋白5.36 0.45531.10 0.61727.81 0.13931.10 0.6173.1.1.1.08 76 75 760.0.0.0.096267391267別藻藍蛋白8.89 0.15427.77 0.18919.57 0.05627.77 0.1897.8.6.8.59 64 40 640.0.0.0.253050146050總藻膽蛋白33.48 0.292125.93 0.509*100.8

19、0 0.260125.93 0.509*25.53 0.37660.43 0.184*47.74 0.18560.43 0.184*(mg g-1)葉綠素a0.44 0.0104.57 0.026*0.48 0.0364.82 0.006*0.46 0.0105.47 0.021*2.04 0.0045.47 0.021*桔色型說明:*為差異顯著(P0.05),*為差異極顯著(P0.01).3)被測藻體的質量.被測藻體的質量對藻膽蛋白和葉綠素a的質量比的測定結果沒有明顯的影響(見圖3,表3).表3 藻體質量對測定葉綠素a的質量比的影響Tab 4 Thecontentofch.lawithdif

20、ferentweightsofP haitanensis(mg g-1)品系紫色型桔色型0.01g實驗組4.98 0.0064.74 0.0140.03g實驗組4.80 0.0024.71 0.0080.05g實驗組4.20 0.0044.66 0.0014)凍融次數(shù)與研磨溫度.藻膽蛋白的含量隨著凍融次數(shù)的增加而略有增加,研磨溫度對藻膽蛋白的測定結果影響較小(見表4).表4 不同凍融次數(shù)和研磨溫度對藻膽蛋白的質量比的影響Tab 4 Thecontentofphycobiliproteinofdifferentfreezethawingtmiesandtemperature(mg g-1)品系處

21、理條件不凍融凍融3次凍融6次4 室溫20 不凍融凍融3次凍融6次4 室溫20藻紅蛋白63.63 0.14066.76 0.16167.06 0.69367.06 0.69365.71 0.15745.51.53.53.49.99 18 34 34 820.0.0.0.0.596159166166331藻藍蛋白26.99 0.40828.67 0.20131.10 0.61731.10 0.61730.59 0.2464.4.4.4.3.30 04 61 61 330.0.0.0.0.176188192192133別藻藍蛋白24.22 0.61424.67 0.52827.77 0.18927.

22、77 0.18927.89 0.51812.12.12.12.12.78 83 96 96 820.0.0.0.0.056224254254096總藻膽蛋白114.84 0.261*120.11 0.768*125.93 0.509125.93 0.509124.19 0.41463.68.70.70.65.07 05 91 91 970.0.0.0.0.420259522522*476紫色型桔色型*.).第3期史修周,等:壇紫菜藻膽蛋白及葉綠素a的測定與分析 225 3 討論3 1 壇紫菜色素含量與生長的關系壇紫菜選育可以通過蛋白質、藻膽蛋白以及葉綠素a含量、生長速度、藻體厚度等重要指標來確

23、定其品種的優(yōu)劣.藻膽蛋白是壇紫菜光合作用中重要的輔助色素蛋白,其中藻紅蛋白在紅藻的捕光色素系統(tǒng)中首先捕獲光能,然后傳遞給藻藍蛋白,再傳遞給別藻藍蛋白;藻膽蛋白還可以作為藻體細胞的貯存蛋白,有利于藻類在自然界中的生存競爭4.壇紫菜在不同生長期,藻膽蛋白總量占干壇紫菜的百分含量由初期到盛期基本不變,到末期大幅度減少.藻膽蛋白在藻體細胞中直接參與光合作用7中的能量吸收和傳遞.葉綠素a是壇紫菜重要的光合色素,含量的高低與藻體本身的營養(yǎng)生長旺盛與否密切相關.本實驗結果表明不同色澤的壇紫菜4種主要色素的差異顯著,其中褐色型藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量較高,相應地該品系的藻體生長較快;而生長相對較慢的桔紅色

24、型藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量較低.這充分證明了藻膽色素和葉綠素a作為紫菜光合作用的捕光色素,與紫菜生長的關系密切.3 2 測定條件對壇紫菜色素含量測定結果影響的分析藻膽蛋白屬于胞內(nèi)蛋白質,要破碎海藻細胞的細胞壁、細胞膜,才能使藻膽蛋白以溶解的狀態(tài)釋放出來,并注意保持其活性.細胞破碎程度越高,藻膽蛋白的得率和純度也越高,不同的細胞破碎方法提取效果不同.因此,采用何種細胞破碎技術是直接影響藻膽蛋白提取效率的關鍵因素之一15.本實驗以藻膽蛋白含量測定結果為指標,對研磨法和反復凍融法的破壁效果進行比較,結果顯示研磨法能破碎80%以上的細胞,若將研磨法和反復凍融法結合起來,先用研磨法破碎絕大多數(shù)的細胞

25、,針對游離的細胞再用反復凍融法使其破碎,能更加準確地測定細胞的胞內(nèi)物質含量.藻膽蛋白在受熱或強光照射時易變性16-18,葉綠素受光照時容易氧化分解5,因此在提取過程中應避免光照并保持低溫.3 3 壇紫菜主要色素的應用前景展望壇紫菜作為一種經(jīng)濟價值很高的紅藻,具有多種生物活性成分,如紫菜的多糖具有降血脂、免疫調節(jié)、抗凝血等功能;紫菜的 -胡蘿卜素能猝滅生物體內(nèi)化學活性很高的自由基,從而降低因自由基誘發(fā)的過氧化作用,具有延緩衰老和抵抗癌癥的作用.而且壇紫菜除了其食用、藥用、營養(yǎng)和提取活性物質等價值外,不同色澤的壇紫菜在發(fā)展觀賞業(yè)、提取色素和制成色澤鮮艷的食品等方面都具有重要的開發(fā)價值.藻膽蛋白作為

26、紫菜體內(nèi)的捕光色素蛋白和胞內(nèi)儲存蛋白,同樣也具有重要的生理功能;而葉綠素不僅與生長速度有很大關系,并且干紫菜中葉綠素含量的多少跟感官評定紫菜優(yōu)1劣最為一致.因此,本研究能更加準確地測定藻膽蛋白和葉綠素a含量,為紫菜優(yōu)良品種的選育和應用提供依據(jù).本研究還初步探討了藻膽蛋白和葉綠素a含量與培養(yǎng)環(huán)境的關系,但是,對于環(huán)境因素所引起的細胞在微觀水平上的變化及生理機理,還有待于進一步的研究.19-20參考文獻1黃秋,左正宏,李勇斌,等.25(2):250 255.2曾呈奎,王素娟,劉思儉,等.藻類栽培學M.上海:上?？萍汲霭嫔?1985:135 211.1993,24(4):351 355.199 21

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