吸附樹脂提純麥冬總皂苷的研究

1、吸附樹脂提純麥冬總皂苷的研究        【摘要】     目的研究純化麥冬總皂苷的工藝條件。方法利用AB-8大孔吸附樹脂吸附麥冬總皂苷，用乙醇梯度洗脫，確定麥冬總皂苷的吸附容量，考察洗脫條件，確定洗脫參數(shù)。結(jié)果AB-8大孔吸附樹脂吸附容量為53.16 mg/ml，乙醇濃度在80%洗脫麥冬總皂苷效果最佳，回收率為85.49%。結(jié)論該方法簡單，方便，純化效果良好，結(jié)果滿意。     【關(guān)鍵詞】  麥冬 大孔吸附樹脂

2、總皂苷    Study on the Purification of Ophiopogon japonicus Total Saponins with Absorption ResinCHE Renguo， SHEN Hongwei， SHANG Xiumei， FU Shaoping ， JIN Fengxie， YU Hongshan*(College of Bio. & Food Technology , Dalian Institute of Light Industry, Dalian 116034, China)Abstract：O

3、bjectiveTo purify the total saponins in root of Ophiopogon japonicus.MethodsWe made use of AB-8 resin column to absorb saponins and alcohol to elute in different concentrations, confirmed the static absorption capacity of total saponins and studied elution requirement and parameter ascertainment of

4、AB-8 resin.ResultsThe total saponin absorption amount  of AB-8 resin column reached 53.16 mg/ml. When the alcohol was used for washing buffer, the best concentration of alcohol for eluting saponins was 80% and the recovery rate was 85.49%.ConclusionThis method is sensitive and accurate.Key word

5、s：Ophiopogon japonicus；  Resin column；  Saponins    麥冬為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus(L.f.) Ker-Gawl. 的干燥塊根，是一味常用滋陰中藥，始載于神農(nóng)本草經(jīng)，歷代重要本草都有記載。其味甘、微苦，性微寒，歸心、肺、胃經(jīng)，有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效，可用于熱病傷津、心煩口渴等病癥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，麥冬含有甾體皂苷、高異黃酮、多糖1，2、氨基酸等成分3，其中麥冬皂苷類成分具有耐缺氧、抗腫瘤、降血糖等作用4，在中醫(yī)臨床上用于治療冠心病、心絞痛，并取得了一定療效。目前

6、，國內(nèi)外利用大孔吸附樹脂對麥冬皂苷純化的研究比較少，主要是研究麥冬皂苷乙醇提取工藝5，6，利用硅膠樹脂純化麥冬皂苷以及HPLC-ELSD法測定川麥冬中有效成分含量7。本實驗考查了AB-8大孔吸附樹脂對麥冬總皂苷的吸附能力，并對麥冬總皂苷進(jìn)行純化，用不同梯度的乙醇對麥冬總皂苷進(jìn)行洗脫，測定不同梯度洗脫液中麥冬總皂苷的含量，利用HPLC檢測不同梯度洗脫的皂苷成分，以期為麥冬總皂苷的分離純化提供有利的依據(jù)。1  器材    麥冬,市售，浙江慈溪產(chǎn)；對照品（短葶山麥冬皂苷C）、80%短葶山麥冬皂苷由中國藥科大學(xué)余伯陽教授提供；AB-8大孔吸附樹脂(天津農(nóng)藥股份有

7、限公司樹脂分公司)；SGK一2LB(5LB)低噪音空氣泵(日本三菱化成公司生產(chǎn))；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(日本三菱化成公司生產(chǎn))；薄層層析板Silica gel 60 F254為Merck公司產(chǎn)品；其它試劑均為分析純或生化純。2  方法2.1  麥冬總皂苷的制備取0.2 kg麥冬粉末以6 L的70乙醇浸泡2 d，過濾出浸出液，蒸餾后用等體積石油醚脫脂兩次，分離得到麥冬總皂苷溶液。按上述過程提取兩次，麥冬總皂苷溶液濃縮至1/10體積，備用。2.2  麥冬總皂苷的含量測定8精密稱量對照品3.7 mg于50 ml量瓶中，甲醇定容。精密吸取0.3，0.5，1.0，1.5，

8、2.0 ml標(biāo)準(zhǔn)溶液置于平底燒瓶中，蒸干。加入高氯酸（70.0%72.0%）10   ml，密塞，65水浴加熱15 min，冰水停止反應(yīng)，14 h內(nèi)于295，325 nm波長測定吸收值，高氯酸為空白。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸收差值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性范圍215 g/ml，得回歸方程。    麥冬總皂苷被測組分按上述步驟，測定295，325 nm波長的吸收值，將吸收差值（A）代入回歸方程可以算得麥冬總皂苷的濃度（C），進(jìn)而得麥冬總皂苷的含量，計算式如下：麥冬總皂苷含量=麥冬總皂苷濃度×被測麥冬總皂苷體積。2.3 

9、 AB-8大孔吸附樹脂對麥冬總皂苷的靜態(tài)吸附容量的測定采用靜態(tài)吸附量實驗來確定AB-8大孔吸附樹脂對麥冬總皂苷的吸附容量，主要考察單位體積的AB-8濕樹脂對麥冬總皂苷的吸附能力。    準(zhǔn)確量取經(jīng)預(yù)處理的AB-8濕樹脂10 ml置于250 ml具塞三角瓶中，加入100 ml麥冬總皂苷溶液（初始濃度已由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出），室溫下置于振蕩器上振蕩24 h，充分吸附后，過濾，分別在295，325 nm波長下測定吸附后的麥冬總皂苷的吸光值，得到吸收差值（A），代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出吸附后麥冬總皂苷的濃度，按下式計算樹脂飽和吸附容量(mg/ml)：  &

10、#160; 飽和吸附容量=(初始濃度-吸附后濃度)×吸附液體積樹脂量2.4  AB-8大孔吸附樹脂乙醇洗脫條件的確定將提取的麥冬總皂苷濃縮液上AB-8大孔吸附樹脂，流出液重復(fù)吸附4次，用10倍樹脂體積的水洗，用10倍樹脂體積的乙醇濃度分別為10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，95%進(jìn)行梯度洗脫，收集各梯度洗脫組分，定容。由“2.2”項所示方法測定并計算出各乙醇梯度洗脫液中的麥冬總皂苷含量。    以乙醇濃度（%）為橫坐標(biāo)，麥冬總皂苷含量（mg/ml）為縱坐標(biāo)作圖，繪制洗脫曲線，并計算回收率（洗脫皂苷質(zhì)量/上樣皂苷質(zhì)量

11、），從而確定最佳的乙醇洗脫濃度。2.5  薄層層析（TLC）法檢測麥冬總皂苷本文采用薄層層析法對不同乙醇濃度梯度洗脫出的麥冬總皂苷進(jìn)行初步檢測。點樣量10 l左右，展開劑為醋酸乙酯甲醇水 = 580.5。展開后吹干，在10%的H2SO4溶液顯色檢測麥冬總皂苷斑點分布情況。2.6  高效液相色譜（HPLC）法檢測麥冬總皂苷儀器為Waters Alliance 2695-2966 DAD，色譜柱為Hypersil ODS2 (4.6 mm×150 mm，5m)，檢驗波長218 nm，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量10 l，柱溫35。流動相A為乙腈，B為水，梯度洗脫條

12、件如表1。表1  梯度洗脫條件（略）3  結(jié)果3.1  標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制由實驗方法“2.2”項繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。由圖1可見，在215 g/ml范圍內(nèi)，麥冬皂苷濃度（C）與吸收差值（A）成線性關(guān)系，其線性回歸方程為：A = -0.005 51 + 6.532 45C，相關(guān)系數(shù)R0.999 21，說明麥冬皂苷濃度與吸收差值線性顯著相關(guān)。圖1  麥冬總皂苷含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線（略）3.2  AB-8大孔吸附樹脂對麥冬總皂苷的靜態(tài)吸附容量取80%短葶山麥冬皂苷573 mg溶于100 ml純凈水中，按“2.3”項方法進(jìn)行操作。經(jīng)“2.2”項方法測定，麥冬

13、皂苷上樣前初始濃度為5.330 mg/ml，經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂吸附后樣品濃度為0.015 mg/ml。最終計算得出AB-8大孔吸附樹脂對麥冬皂苷的靜態(tài)吸附容量為53.16 mg/ml。3.3  麥冬總皂苷的提取按照“2.1”項方法，從0.2 kg麥冬粉末中提取得到麥冬總皂苷溶液，濃縮蒸干為粉末狀，得到麥冬總皂苷粗品10.91 g，提取率為5.46%。3.4  AB-8大孔吸附樹脂乙醇洗脫條件的確定在樹脂柱中裝入預(yù)處理后的AB-8大孔吸附樹脂10 ml，取提取得到的麥冬總皂苷0.50 g，溶解在100 ml的去離子水中，上柱，流出液重復(fù)吸附4次。再依次用離子水100 ml

14、,體積分?jǐn)?shù)10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，95%的乙醇溶液各100 ml 進(jìn)行分步梯度洗脫，將不同乙醇濃度的梯度洗脫液分別收集，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容至10ml。測定不同乙醇濃度梯度洗脫液中麥冬總皂苷含量，以乙醇濃度為橫坐標(biāo),麥冬總皂苷含量為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。見圖2。圖2  麥冬總皂苷在不同乙醇濃度下的洗脫曲線（略）    按“2.4”項方法，將10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，95%乙醇分步梯度洗脫所得的麥冬總皂苷進(jìn)行薄層層析（TLC）檢測，如圖3。圖3  AB-8大孔吸附樹脂分離提純

15、麥冬總皂苷乙醇梯度洗脫液中麥冬總皂苷的薄層色譜圖（略）    由圖2可見，隨著乙醇濃度的加大，洗脫液中的麥冬總皂苷濃度也在增加。乙醇濃度在60%時，洗脫液中的麥冬總皂苷濃度達(dá)到最大值，為88.46 mg/ml，之后逐漸下降。80%的乙醇濃度下已將大部分的麥冬總皂苷洗脫下來。    由圖3中的薄層層析斑點分布情況和顏色深淺可見，在1030乙醇濃度下麥冬皂苷的洗出量非常少。在5080乙醇濃度下麥冬總皂苷的洗出量明顯增加，在80%乙醇濃度洗脫下麥冬總皂苷已基本洗出。至95%乙醇濃度洗脫，斑點數(shù)量明顯減少，并且組分主要集中在薄層層析Rf 0.

16、883的最頂處，這與圖2中得到的結(jié)果基本相符。圖3中的短葶山麥冬皂苷C的薄層層析斑點對應(yīng)在Rf 0.520處，從5080乙醇濃度下麥冬總皂苷洗脫出的斑點看，含有短葶山麥冬皂苷C，說明用80乙醇洗脫就可以洗出包含短葶山麥冬皂苷C在內(nèi)的麥冬總皂苷。    將1080不同乙醇濃度梯度洗脫液合并，蒸干，得到麥冬總皂苷粉末427.45  mg，經(jīng)計算回收率為85.49%。    經(jīng)以上分析，同時考慮到生產(chǎn)中節(jié)省乙醇的目的，確定利用AB-8大孔吸附樹脂提純麥冬總皂苷，洗脫液采用80乙醇溶液。3.5  高效液相色譜的定性檢測對麥

17、冬總皂苷粗品、短葶山麥冬皂苷C、乙醇濃度為30%、80%和95%梯度洗脫的麥冬總皂苷組分，采用“2.6”項方法，進(jìn)行了HPLC定性檢測。結(jié)果如圖48所示。圖4  麥冬總皂苷粗品的HPLC圖譜（略）圖5  短葶山麥冬皂苷C的HPLC圖譜（略）圖6  濃度為30%乙醇梯度洗脫組分的HPLC圖譜（略）圖7  濃度為80%乙醇梯度洗脫組分的HPLC圖譜（略）4  結(jié)論    在麥冬總皂苷的提取中，AB-8大孔吸附樹脂具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附和交換容量大、選擇性好、吸附和交換速度快、吸附條件溫和、再生處理方便、

18、強度好、使用壽命長等優(yōu)點。本實驗利用AB-8大孔吸附樹脂提純麥冬總皂苷，將中藥麥冬用酒精提取得到的麥冬總皂苷，經(jīng)脫糖、除雜處理后得到?jīng)]有雜質(zhì)的麥冬總皂苷。利用麥冬總皂苷含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線對麥冬總皂苷的靜態(tài)吸附容量進(jìn)行了測定，其結(jié)果為53.16 mg/ml。將麥冬總皂苷經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行乙醇梯度的分步洗脫，通過分析麥冬總皂苷在不同乙醇濃度下的洗脫曲線、麥冬總皂苷乙醇梯度洗脫液中麥冬總皂苷的薄層色譜圖和高效液相色譜的定性檢測，結(jié)果表明，在利用AB-8大孔吸附樹脂提純麥冬總皂苷中，用80%濃度乙醇洗脫出的麥冬總皂苷量多，回收率為85.49%。    此外“大孔吸

19、附樹脂使用安全問題”，即致孔劑和降解物的毒性等也應(yīng)得到充分考慮。鑒于此國家衛(wèi)生部也明文規(guī)定了“在保健食品中采用大孔吸附樹脂工藝的技術(shù)要求”，其中就成品中二乙烯苯的殘留量應(yīng)小于50ppb及其檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)作出了規(guī)定。本論文中采用AB-8大孔吸附樹脂是天津農(nóng)藥股份有限公司樹脂分公司生產(chǎn)的，所用溶劑與酸堿均采用食品級進(jìn)行預(yù)處理，采用頂空進(jìn)樣的氣相色譜檢測處理后的樹脂中殘留的二乙烯苯遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于50ppb。通過實驗也發(fā)現(xiàn)該大孔吸附樹脂對甾體皂苷類化合物有很好的分離純化作用。論文中得出的相關(guān)AB-8大孔吸附樹脂工藝條件也必將對今后的研究和生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。    【參考文獻(xiàn)】  1 劉吉華,余伯陽.麥冬多糖精制方法的比較J.植物資料與環(huán)境學(xué)報,2003,12(3):55.2 Xiao Lin,De Sheng Xu,Yi Feng,et al.Determination of Ophiopogon j