異葉敗醬中三萜化合物常春藤皂苷元對人早幼粒白血病

1、異葉敗醬中三萜化合物常春藤皂苷元對人早幼粒白血病細胞HL-60的增殖抑制、周期阻滯及凋亡誘導(dǎo)的作用丁 蘭，侯 茜，徐福春，張 瓊，王 瀚，劉國安（西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅，蘭州，730070）摘要：利用倒置顯微鏡觀察法、臺盼藍排染法、hoechst33258熒光染色法、DNA ladder電泳以及流式細胞分析技術(shù)，檢測了從甘肅產(chǎn)異葉敗醬中分離得到的三萜化合物常春藤皂苷元（HG）對人早幼粒白血病細胞HL-60的增殖抑制、周期阻滯及凋亡誘導(dǎo)作用結(jié)果表明，常春藤皂苷元在較低濃度（1040molL-1）條件下，對HL-60細胞增殖具有良好的抑制作用；在較高濃度（4050molL-1）條件下，對

2、HL-60細胞具有致死作用；同時，常春藤皂苷元對HL-60細胞的G1期阻滯和凋亡誘導(dǎo)作用極可能是其實現(xiàn)增殖抑制和致死作用的主要途徑關(guān)鍵詞：常春藤皂苷元；人早幼粒白血病細胞；生長抑制；周期阻滯；凋亡中圖分類號：Q946；Q255 文獻標(biāo)示碼：A 文章編號：The effect of Hederagenin，a triterpnoid from Patrinia heterophylla Bunge.on the proliferation inhibition，cell cycle arrest and apoptosisof Human promyelocytic leukemia HL-60

3、 cellsDING Lan，HOU Qian，XU Fu-chun，ZHANG Qiong，WANG Han，LIU Guo-an（College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，Gansu，China）Abstract：The effects of Hederagenin（HG），a triterpnoid from Patrinia heterophylla，on the proliferation inhibition，cell cycle arrest and apoptosis of Human

4、promyelocytic leukemia HL-60 cells were measured by morphological observation，typanblue exclusion method， Hoechst 33258 stain assay，DNA ladder and flow cytometry respectively The results showed that Hederagenin could inhibit the proliferation of HL-60 at low concentrations（1040molL-1）while make the

5、cells death at the high concentrations（4050molL-1）It suggested that HG could make proliferation inhibition and cell death on HL-60 cells through G1 phase arrest and apoptosis Key words：Hederagenin；Human promyelocytic leukemia cells；cell cycle arrest；proliferation inhibition；apoptosis 基金項目：甘肅省教育廳科研資助

6、項目（0601-27）作者簡介：丁蘭（1964），女，四川德陽人，教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師. 主要研究方向為天然藥物化學(xué)與細胞工程。E-mail：dinglan異葉敗醬（Patrinia heterophylla Bunge）是敗醬科（Valerianaceae）敗醬屬（Patrinia Juss）植物多年生草本植物1，也是傳統(tǒng)中藥材墓頭回的藥源植物之一，墓頭回的另一藥源植物為糙葉敗醬，臨床上將其用于治療白血病2，3、具有很好的療效，同時墓頭回還用于治療子宮癌，子宮頸癌，胃癌病等1目前，對于上述2種植物的化學(xué)成分的研究已有了較為系統(tǒng)的報道4，5，6，其主要的化學(xué)成分為三萜類化合物，包括熊果酸

7、、齊墩果酸，敗醬皂苷和常春藤皂苷等7有關(guān)這2種植物抗腫瘤的研究主要還集中在植物粗提物的體內(nèi)外抗腫瘤測試8，9，10，如：有研究表明兩種植物的水提物對小鼠S180肉瘤抑制率達62.5%，并觀察到是直接殺傷作用8而其單體化合物的抗腫瘤研究非常有限，因而，目前尚不能知道哪種（哪些）化合物在對白血病治療過程中起著主導(dǎo)作用本課題組從甘肅隴南地區(qū)的異葉敗醬中分離得到了10余種化合物，鑒定出7個三萜化合物、2 個甾體化合物和1個三萜皂甙，并用SRB法對其中分離到的得率較高的化合物進行體外毒性測試，部分化合物表現(xiàn)出較高的抗癌活性，但對其抗癌機理沒有進一步研究6常春藤皂苷元(hederagenin，縮寫為HG)

8、（化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖一所示）是所分離的7個三萜化合物中，得率高，且細胞毒性較強的1種有關(guān)常春藤皂苷元抗腫瘤研究很少，李祖強11等用小鼠白血病細胞（L1210），人結(jié)腸癌細胞 (LS174T)等癌細胞株對山苦瓜中常春藤皂苷元成分進行了體外細胞毒性測試，結(jié)果表明，常春藤皂苷元較好的細胞毒活性因此，進一步研究該化合物的抗腫瘤作用及其機理，對于明晰異葉敗醬抗癌化學(xué)成分以及發(fā)現(xiàn)其中的抗癌先導(dǎo)化合物非常必要該文研究了常春藤皂苷元在不同濃度及時間條件下對人早幼粒白血病細胞HL-60的增殖、細胞周期及凋亡的影響，為進一步闡明抗癌中藥墓頭回的抗癌成分及作用機理提供科學(xué)依據(jù)圖1 Hederagenin化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig

9、1 Chemical structure of Hederagenin1 材料與方法1.1 材料單體化合物常春藤皂苷元(HG)，由本課題組從甘肅隴南地區(qū)的異葉敗醬中分離得到6，將藥物溶于DMSO，在4冰箱中保存?zhèn)溆萌嗽缬琢０籽〖毎鸋L-60引自蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院RMPI-1640培養(yǎng)基為Gibco原裝；胰蛋白酶購自Sigma公司；新生小牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)有限公司；Heochst33258熒光染料，溴化乙啶（EB）購自美國Sigma公司細胞培養(yǎng)板為美國Costar；超凈工作臺為蘇凈集團安泰公司生產(chǎn)；二氧化碳飽和濕度恒溫箱（美國Forma Scientific）；Leitz-diav

10、ert倒置顯微鏡；Olympus熒光顯微鏡1.2 方法1.2.1 細胞培養(yǎng) 人早幼粒白血病細胞HL-60培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，加青霉素100gmL-1，鏈霉素100gmL-1，置于5% CO2，37飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng)1.2.2 HG對HL-60細胞生長影響的形態(tài)學(xué)觀察 將處于對數(shù)生長期的HL-60細胞，以5104個mL-1濃度接種于培養(yǎng)瓶中，同時加入不同濃度的HG母液，使培養(yǎng)液中HG的終濃度分別為：0，10，20，30，40，50molL-1，然后將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)分別在培養(yǎng)24h，48h，72h后取出細胞培養(yǎng)瓶，在倒置顯微鏡下觀察拍照1.2.3 生長曲線

11、法測定HG對HL-60細胞增殖的影響 將濃度為5104個mL-1細胞接種與24孔板中，每孔接種1mL，每濃度設(shè)立3個平行組，接種的同時加入藥物，培養(yǎng)液藥物的終濃度分別為0，10，20，30，40，50molL-1將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12h，取005mL臺盼藍染液與045mL細胞懸液充分混勻，染色5min后吸取適量細胞懸液，注入血細胞計數(shù)板小室，對活細胞計數(shù)，重復(fù)3次，取平均值以時間為橫坐標(biāo)（h），細胞數(shù)為縱坐標(biāo)（104），繪制生長曲線1.2.4 Hoechst33258熒光染色法檢測HG誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡 取1105個mL-1濃度的細胞懸液，接種于6孔板中，每孔2mL，同時加入藥

12、物，6個孔中藥物的終濃度為0，10，20，30，40，50molL-1，分別于培養(yǎng)24h，48h，72h后取出，離心收集（500 rmin1），用預(yù)冷的PBS洗兩次，甲醇固定10min，再用預(yù)冷的PBS洗三次，涂片晾干用10gmL-1的Heochst33258在室溫避光下染色10min，蒸餾水沖洗3次，晾干后，熒光顯微鏡下觀察并拍照（激發(fā)波長為340nm）1.2.5 DNA ladder電泳法檢測HG誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡 分別離心（800 rmin1）收集0，10，20，30，40，50molL-1濃度HG處理的HL-60細胞，用預(yù)冷的PBS洗兩次，加入細胞裂解液（10 mmolL-1 Tr

13、is-Hcl，pH=8.0，10 mmolL-1EDTA，05%的TritonX-100），于50恒溫水浴鍋中消化2h后，取出離心（12 000 rmin1），取上清液在上清液中加入50 uL的RNaseA（20mgmL-1），在37下孵育1h后，加入5L的蛋白酶K（20mgmL-1），又在37下孵育1h后，取出離心10min（12 000 rmin1）上清液用 2.5 倍體積的異丙醇和 1/10 體積 0.5 molL-1 的 NaCl 溶液沉淀DNA，于20 下24h后取出，離心10min（12 000 rmin1），棄去上清液，沉淀用TE溶液溶解（10 mmolL-1Tris-Hcl，p

14、H=8.0，1mmolL-1EDTA），用15%瓊脂糖凝膠在90V恒壓下電泳25h，EB染色，UVI凝膠圖像分析儀下檢測，并用自動成像系統(tǒng)拍照1.2.6 流式細胞儀檢測HG影響HL-60細胞周期及誘導(dǎo)細胞凋亡 將處于對數(shù)生長期的HL-60細胞，以5104個mL-1接種與培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后，加入藥物，終濃度為40molL-1于24，36，48，60，72h分別收集細胞，于4下75%乙醇中固定24h以上，取出后PBS洗兩遍加入PI( 5105 gmL-1)在黑暗條件下染色30min，用流式細胞儀對其進行細胞周期和凋亡分析2 結(jié)果與討論2.1 HG對HL-60細胞生長的影響如圖2所示，當(dāng)濃度為1

15、0，20，30，40molL-1的HG作用于HL-60細胞24h時，10，20，30molL-1的HG對細胞形態(tài)影響很小，與對照組相比細胞形態(tài)正常，有小細胞團的形成，但細胞增殖有逐漸降低的趨勢；當(dāng)40molL-1藥物作用于細胞時，細胞形態(tài)改變，體積縮小，細胞表面皺縮，并可見明顯的顆粒沉淀當(dāng)同樣藥物濃度作用于細胞48h后，10molL-1細胞形態(tài)正常，細胞克隆形成細胞團，與對照相比沒有明顯區(qū)別；但當(dāng)20和30molL-1HG處理時，細胞團明顯變小，細胞數(shù)變少，說明細胞生長受到明顯抑制；40molL-1使細胞形態(tài)完全改變，細胞數(shù)參考文獻:1 南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥大辭典(下冊) M 上海: 上?？茖W(xué)技

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