高效液相色譜質(zhì)譜法快速鑒定復(fù)方毛冬青沖劑中三萜皂苷活性成分

1、高效液相色譜質(zhì)譜法快速鑒定復(fù)方毛冬青沖劑中三萜皂苷活性成分You never know what you can do till you. We are here to add what we can to life, not to get what we can from it. 作者：楊運云郭鵬然陳怡祿鄧六勤鐘鳴吳慶暉【摘要】建立了高效液相色譜質(zhì)譜法(HPLCMS)快速鑒定復(fù)方毛冬青沖劑中三萜皂苷活性成分的方法。以甲醇為萃取劑超聲萃取復(fù)方毛冬青沖劑30min。采用高效液相色譜離子阱質(zhì)譜(HPLCITMS)和高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜(HPLCTOFMS)對萃取液進行分析，選用AgilentZ

2、orbaxEclipseXDBC18色譜柱(250mm4.6mm,5m)，以水(含0.1%甲酸)乙腈為流動相進行梯度洗脫，柱后流出液采用電噴霧離子阱質(zhì)譜(ESIITMS)和電噴霧飛行時間質(zhì)譜(ESITOFMS)的正、負離子模式進行檢測。檢測結(jié)果經(jīng)離子阱一級質(zhì)譜(ITMS1)、離子阱二級質(zhì)譜(ITMS2)和分析時間質(zhì)譜(TOFMS)信息分析，并與相關(guān)文獻報道進行比較，鑒定出1種三萜酸和8種三萜皂苷成分，并推測了其它3種可能的三萜皂苷化學(xué)成分，通過對照品對比分析，三萜酸確證為IlexgeninA，其中一種三萜皂苷確證為IlexsaponinA1()。本方法無需對照品即可快速有效地鑒定出復(fù)方毛冬青沖

3、劑中的三萜皂苷活性成分，為建立沖劑的質(zhì)量標準提供了依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】復(fù)方毛冬青沖劑，三萜皂苷，高效液相色譜質(zhì)譜1引言Time is money, but money is not time. 毛冬青(Radixilicispubescentis)為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬植物毛冬青(IlexpubescensHook.etAm.)的干燥根，是我國南方常用中藥，已有多種成方制劑如毛冬青膠囊、毛冬青注射液、復(fù)方毛冬青氯貝酸鋁片和復(fù)方毛冬青沖劑等收載于部頒標準,主要用于治療循環(huán)系統(tǒng)疾病，有擴張血管及抗菌消炎的功效1。Early mistakes are the seeds of fu

4、ture trouble. 目前，市售毛冬青品種混亂，化學(xué)成分和藥理作用差別較大，從而導(dǎo)致了毛冬青制劑的質(zhì)量難以控制。因此，建立快速、有效地監(jiān)測毛冬青制劑質(zhì)量標準的方法十分必要。已報道的毛冬青的主要化學(xué)成分有齊墩果烷型和烏索烷型三萜酸及皂苷類、黃酮類、木脂素類、酚酸類、脂肪酸和糖脂類等化合物210。其中IlexosideO2，IlexgeninA3，IlexsaponinA13，IlexsaponinB7,B14,B24,B34,B45和IlexsaponinC5,6等三萜酸和三萜皂苷被認為是其主要活性成分。復(fù)方毛冬青沖劑由毛冬青、板藍根和大青葉3味中藥材經(jīng)適宜工藝制成，三萜酸和三萜皂苷仍為沖

5、劑的主要活性成分(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。由于沖劑中糖類輔料等基體物質(zhì)的含量很高，且三萜皂苷化合物的紫外吸收很弱，要通過高效液相色譜紫外檢測(HPLCUV)或高效液相色譜二極管陣列檢測(HPLCDAD)測定其含量非常困難，并且還需要價格昂貴的對照品。HPLCMS檢測三萜皂苷類物質(zhì)靈敏度很高，并能在線提供每個譜峰的分子量和結(jié)構(gòu)信息，在不需要對照品的情況下，可以快速鑒定出復(fù)方毛冬青沖劑中的三萜酸和三萜皂苷活性成分，是沖劑質(zhì)量標準和指紋圖譜建立的有效手段之一。2實驗部分2.1儀器與試劑 1100HPLCMSTrapXCT高效液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);1200HPLCMST

6、OF高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);ZorbaxEclipseXDBC18高效液相色譜柱(250mm4.6mm,5m，美國Agilent公司)。復(fù)方毛冬青沖劑(廣州市兒童醫(yī)院);甲醇和乙腈均為色譜純(美國Burdick&Jackson公司)，實驗用水為超純水，由超純水設(shè)備(美國MiliQ公司)制備。2.2實驗步驟Know thyself. 3結(jié)果與討論Good counsel never comes too late. 3.1HPLCMS分析結(jié)果三萜皂苷類化合物ESIMS正、負離子模式下的離子化效果均很理想。圖1為復(fù)方毛冬青沖劑萃取液的HPLCITMS正、負離子全掃描

7、質(zhì)量色譜圖。文獻10報道毛冬青藥材反相C18柱HPLC圖譜有兩個指紋區(qū)。一個區(qū)的保留較弱(保留時間tR較短)，在245320nm有紫外吸收，主要為木酯素類化合物;另外一個區(qū)的保留較強(tR較長)，波長210nm以上無明顯紫外吸收，低含量用HPLC法測定非常困難，主要為三萜酸和三萜皂苷類化合物。本研究所得HPLCMS圖譜與文獻10類似，tR33min為三萜酸和三萜皂苷類化合物的指紋區(qū)。圖1復(fù)方毛冬青沖劑萃取液的正離子(A)和負離子(B)HPLCITMS全掃描質(zhì)量色譜圖Fig.1LiquidchromatogramsobtainedbyTICfrompositive(A)andnegative(B

8、)iontrap(IT)MSofcompoundRadixilicispubescentismedicinalgranules3.2三萜皂苷化合物的鑒定文獻報道毛冬青中所含的三萜酸和三萜皂苷類化合物多以毛冬青酸(Ilexolicacid)，IlexgeninA，IlexgeninB和IlexgeninC為苷元27，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖2。A faithful friend is hard to find. 分析復(fù)方毛冬青沖劑HPLCMS色譜圖中每個譜峰的ITMS1，ITMS2和TOFMS信息，并與已報道的毛冬青中鑒定出來的三萜皂苷活性物質(zhì)進行比較，鑒定出1種三萜酸和8種三萜皂苷化合物，并推測了

9、其它3種可能的三萜皂苷化學(xué)成分，色譜峰如圖1所示。在相同的實驗條件下采用HPLCITMS分析IlexgeninA和IlexsaponinA1對照品，通過比較保留時間和質(zhì)譜信息，色譜峰8確證為IlexsaponinA1，色譜峰12確證為IlexgeninA。Quality is better than quantity. 色譜峰1:tR=35.5min;TOFMS：m/z1092.5951M+NH4+(誤差：0.0002)，1073.5543M-H-(誤差：0.0005)，分子式C53H86O22，M=1074.5611;ITMS1：m/z1097M+Na+，1092M+NH4+，913M+H-

10、Glc+，455M+H-H2O-Glc-XylGlcRha+，437M+H-2H2O-Glc-XylGlcRha+，1119M+HCOO-，1109M+Cl-，1073M-H-;ITMS2：m/z935M+Na-Glc+，911M-H-Glc-,765M-H-Glc-Rha-，603M-H-Glc-GlcRha-;通過與文獻2比較，鑒定為IlexosideO。The peacock has fair feathers, but foul. 圖2毛冬青中已經(jīng)鑒定的三萜酸和三萜皂苷化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2Chemicalstructuresoftriterpeneandsaponinsident

11、ifiedinRadixilicispubescentis色譜峰2:tR=37.2min;TOF-MS：m/z946.5358M+NH4+(誤差：-0.0012)，927.4962M-H-(誤差：0.0003)，分子式C47H76O18，M=928.5032;ITMS1：m/z951M+Na+，946M+NH4+，767M+H-Glc+，455M+H-H2OGlc-XylGlc+，437M+H-2H2O-Glc-XylGlc+，973M+HCOO-，963M+Cl-，927M-H-;ITMS2：m/z789M+Na-Glc+，765M-H-Glc-,603M-H-Glc-Glc-;通過與文獻4

12、比較，鑒定為IlexsaponinB3。If you run after two heares, you will ca. 色譜峰3:tR=39.5min;TOFMS：m/z805.4356M+Na+(誤差：0.0011)，827.4424M+HCOO-(誤差：-0.0011)，分子式C41H66O14，M=782.4453;ITMS1：m/z805M+Na+，471M+H-H2O-Glc-Xyl+，453M+H-2H2O-Glc-Xyl+，437M+H-3H2O-Glc-Xyl+，827M+HCOO-，817M+Cl-;ITMS2：m/z643M+Na-Glc+，619M-H-Glc-;通過

13、與文獻5,6比較，鑒定為IlexsaponinC。色譜峰4:tR=40.3min;TOFMS：m/z844.4676M+NH4+(誤差：-0.0013)，871.4432M+HCOO-(誤差：-0.0001)，分子式C42H66O16，M=826.4351;ITMS1：m/z849M+Na+，844M+NH4+，665M+H-Glc+，503M+H-2Glc+，485M+H-H2O-2Glc+，467M+H-2H2O-2Glc+，421M+H-2H2O-HCOOH-2Glc+，871M+HCOO-，861M+Cl-，825M-H-;ITMS2：m/z503，485，467，421，663M-H

14、-Glc-，501M-H-2Glc-;推測可能為IlexgeninA與2個葡萄糖形成的三萜皂苷。色譜峰5:tR=41.8min;TOFMS：m/z784.4844M+NH4+(誤差：0.0002)，811.4488M+HCOO-(誤差：0.0003)，分子式C41H66O13，M=766.4503;ITMS1：m/z789M+Na+，784M+NH4+，455M+H-H2O-XylGlc+，437M+H-2H2O-XylGlc+，811M+HCOO-，801M+Cl-，765M-H-;ITMS2：m/z627M+Na-Glc+，455，437，603M-H-Glc-;通過與文獻4比較，鑒定為I

15、lexsaponinB1。色譜峰6:tR=44.6min;TOFMS：m/z935.5002M+Na+(誤差：0.0027)，957.5057M+HCOO-(誤差：-0.0008)，分子式C47H76O17，M=912.5083;ITMS1：m/z935M+Na+，930M+NH4+，455M+H-H2O-XylGlcRha+，437M+H-2H2O-XylGlcRha+，957M+HCOO-，947M+Cl-，911M-H-;ITMS2：m/z789M+Na-Rha+，765M-H-Rha-，603M-H-GlcRha-;通過與文獻4比較，鑒定為IlexsaponinB2。論文分為專題型、論

16、辯型、綜述型和綜合型四大類 色譜峰7:tR=45.2min;TOFMS：m/z916.5277M+NH4+(誤差：0.0007)，943.4891M+HCOO-(誤差：-0.0012)，分子式C46H74O17，M=898.4926;ITMS1：m/z921M+Na+，916M+NH4+，455M+H-H2O-XylGlcAra+，437M+H-2H2O-XylGlcAra+，943M+HCOO-，933M+Cl-，897M-H-;ITMS2：m/z789M+Na-Ara+，765M-H-Ara-;通過與文獻5比較，鑒定為IlexsaponinB4。色譜峰8:tR=45.9min;TOFMS：

17、m/z682.4152M+NH4+(誤差：-0.0009)，663.3751M-H-(誤差：0.0001)，分子式C36H56O11，M=664.3823;ITMS1：m/z682M+NH4+，503M+H-Glc+，485M+H-H2O-Glc+，467M+H-2H2O-Glc+，457M+H-HCOOH-Glc+，439M+H-H2O-HCOOH-Glc+，421M+H-2H2O-HCOOH-2Glc+，663M-H-;IT-MS2：m/z503，485，467，457，439，421，663，501M-HGlc-;通過與文獻3比較，鑒定為IlexsaponinA1，并在相同的實驗條件下通

18、過對照品進行了確證。色譜峰9：tR=47.8min;TOFMS：m/z912.5039M+NH4+(誤差：-0.0006)，939.4952M+HCOO-(誤差：-0.0007)，分子式C47H76O16，M=894.4977;ITMS1：m/z917M+Na+，912M+NH4+，437M+H-H2O-Xyl-Glc-Rha+，939M+HCOO-，929M+Cl-，893M-H-;ITMS2：m/z771M+Na-Rha+，437，747M-H-Rha-;推測可能為Ilexolicacid與一個鼠李糖、一個葡萄糖和一個木糖形成的三萜皂苷。色譜峰10：tR=48.8min;TOFMS：m/z

19、603.3896M-H-(誤差：-0.0006)，分子式C35H56O8，M=604.3975;ITMS1：m/z622M+NH4+，455M+H-H2O-Xyl+，437M+H-2H2O-Xyl+，603M-H-;ITMS2：m/z455，437，471M-H-Xyl-;推測可能為IlexgeninB與一個木糖形成的三萜皂苷。Money is the root of all evil. 色譜峰11：tR=49.5min;TOFMS：m/z766.4741M+NH4+(誤差：0.0005)，分子式C41H64O12，M=748.4398;ITMS1：m/z771M+Na+，766M+NH4+，

20、437M+H-H2O-XylGlc+，793M+HCOO-，783M+Cl-，747M-H-;ITMS2：m/z609M+Na-Glc+，437，585M-H-Glc-;通過與文獻7比較，鑒定為IlexsaponinB。It is right to put everything in its proper use. 色譜峰12：tR=52.0min;TOFMS：m/z503.3363M+H+(誤差：-0.0004)，501.3228M-H-(誤差：0.0006)，分子式C30H46O6，M=502.3294;ITMS1：m/z503M+H+，485M+H-H2O+，467M+H-2H2O+，4

21、57M+H-HCOOH+，439M+H-H2O-HCOOH+，421M+H-2H2O-HCOOH+，501M-H-;ITMS2：m/z485，467，457，439，421，483M-H-H2O-，465M-H-2H2O-，455M-H-HCOOH-，437M-H-H2O-HCOOH-，419M-H-2H2O-HCOOH-;通過與文獻3比較，鑒定為IlexgeninA，并在相同的實驗條件下通過對照品進行了確證。 3.3三萜皂苷化合物ESIMS特征質(zhì)譜規(guī)律 表1對以Ilexolicacid，IlexgeninA，IlexgeninB和IlexgeninC為苷元的三萜酸和三萜皂苷化合物ESIMS特

22、征質(zhì)譜規(guī)律進行了總結(jié)，其ESIMS除了可以檢測到m/zM+Na+，M+NH4+，M-H-，M+Cl-，M+HCOO-特征峰以外，正離子ESIMS1還有非常明顯的特征碎片峰，詳細特征峰如下：Ilexolicacid苷元m/z437;IlexgeninA苷元m/z503，485，467，457，439，421;IlexgeninB苷元m/z455，437;IlexgeninC苷元m/z471，453，435。IlexsaponinA，B和C三萜皂苷的正、負ESIMS2表1毛冬青中三萜酸和三萜皂苷的ESIMS質(zhì)譜特征峰We are here to add what we can to life, n

23、ot to get what we can from it. M+HCOO-M+Na-糖苷(indican)+M-H-糖苷(indican)-均可檢測到失去一個或多個糖苷的特征碎片峰，通常情況下，-162為失去一個葡萄糖或半乳糖苷，-146為失去一個鼠李糖苷，-132為失去一個木糖或阿拉伯糖苷。這些規(guī)律可用于快速推測復(fù)方毛冬青沖劑或毛冬青藥材中其它可能存在的三萜皂苷，為新的三萜皂苷化合物鑒定提供理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I】1XiongYouXiang(熊友香),LiChang(李昶),LuoXianTang(羅憲堂).J.ChineseMed.Mat.(中藥材),2002,25(5):3713742HanYN,HanBH,BaikSK,KimTH.U.S.Patent,4987125,19913KazayukiH,MiyokoI,YokoM,