植物組織特異性啟動子研究

1、收稿日期:2007-05-25外源基因在細胞中表達是基因工程研究的關(guān)鍵,而外源基因的表達首先取決于其轉(zhuǎn)錄的啟動。高等植物基因的表達具有時間和空間性。組織特異性啟動子亦稱器官特異性啟動子,在這類啟動子的驅(qū)動下,基因的表達往往只限于某些特定的器官或組織部位,并表現(xiàn)發(fā)育調(diào)節(jié)等特性。組織特異性通常以特定的組織細胞結(jié)構(gòu)和化學、物理信號為基礎(chǔ),與誘導型啟動子有一定的共同點。組織特異性啟動子不僅能使目的基因的表達產(chǎn)物在一定器官或組織部位積累,增加區(qū)域表達量,同時也可以避免植物營養(yǎng)的不必要浪費。作為基因工程中最富有前景的調(diào)控元件,組織特異性啟動子已成為近年研究的熱點之一。對植物組織特異性啟動子進行分類和比較,

2、概述其結(jié)構(gòu)特點、功能及研究進展。1營養(yǎng)器官中表達啟動子1.1葉片特異表達啟動子(green tissue specific pro-moter 葉片作為植物光合作用的器官,在能量的固定和利用中起著十分重要的作用。許多葉特異表達的基因產(chǎn)物都參與了光合過程,因此研究葉特異表達啟動子對相應(yīng)基因表達的調(diào)控機理具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。楊予濤等采用接頭PCR 技術(shù)克隆了PNZIP 基因啟動子,證明在葉片組織中全長PNZIP 啟動子活性比35S 啟動子高9倍,發(fā)現(xiàn)PNZIP啟動子中存在2個可能與光合組織特異表達有關(guān)的新的順式作用元件1,王利軍等克隆了擬南芥atslA 基因啟動子2。另外,在玉米中發(fā)現(xiàn)的

3、C4PdK 基因的啟動子也具有葉肉和葉舌的組織特異性3。1.2韌皮部特異表達啟動子(phloeom specific pro-moter 韌皮部負責植物體內(nèi)有機物的運輸,是植物維管組織的一部分,也是許多植物病蟲害的直接侵害目標,對這類啟動子結(jié)構(gòu)與功能的研究將為植物基因工程的研究提供啟動元件。蔣浩等首次證明筍瓜PP2基因啟動子可驅(qū)動外源基因在異源植物韌皮部及分生組織中特異性表達4。另一種韌皮部特異表達基因是楊樹的樹皮儲藏蛋白BSP (bark storageprotein ,蔣浩初步證明楊樹BSP 基因啟動子有韌皮部表達特性,可介導GUS 基因在轉(zhuǎn)基因煙草韌皮部特異表達5。除高等植物中已發(fā)現(xiàn)的重

4、要的啟植物組織特異性啟動子研究宋揚周軍會張永強(中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所,北京100081摘要:組織特異性啟動子可以調(diào)控基因在某些特定的器官或組織部位中表達。通過對植物組織特異性啟動子進行分類和比較,概述了植物組織特異性啟動子的結(jié)構(gòu)特點、功能及研究進展。關(guān)鍵詞:組織特異性啟動子順式作用元件植物基因工程Research on Plant Tissue-specific PromotersSong Yang Zhou Junhui Zhang Yongqiang(Biotechnology Research Institute ,Chinese Academy of Agricultural

5、Sciences ,Beijing 100081Abstract :Tissue specific promoter can control gene expression in certain organ or tissue.In this paper ,structuralcharacters ,function of promoters and recent advances of studies are reviewed by categorizing and comparing with the plant tissue specific promoters.Key words :T

6、issue specific promoterCis-acting elementPlant genetic engineering生物技術(shù)通報BIOTECHNOLOGY BULLETIN綜述與專論2007年第6期生物技術(shù)通報Biotechnology Bulletin2007年第6期動子外,韌皮部特異表達啟動子還包括:水稻東格魯桿狀病毒(RTBV啟動子、竹節(jié)花黃斑駁病毒(CoYMV啟動子、椰子腐葉病毒(CFDV啟動子、玉米蔗糖合酶-1(Sh基因啟動子、油菜伸展蛋白基因啟動子、發(fā)根農(nóng)桿菌RolA和RolC啟動子等6。此外,楊英軍等克隆了proteinase omega基因的部分序列及其5

7、9;側(cè)翼序列。番木瓜葉組織GUS基因瞬間表達結(jié)果表明,該序列具有驅(qū)動GUS基因在乳管中表達的功能7。1.3維管束特異表達啟動子(vascular bundle spe-cific promoter細菌和真菌性維管束病害常造成嚴重的損失,由于缺乏抗源,常規(guī)抗病育種進展緩慢,加之維管束病害難以用藥劑防治,至今仍為生產(chǎn)中亟待解決的問題之一8。目前己經(jīng)鑒定的維管束特異啟動子較少,研究比較深入的維管束特異表達啟動子主要有:菜豆GRP118(富甘氨酸細胞壁結(jié)構(gòu)蛋白、擬南芥profilin2基因和菜豆苯丙氨酸氨裂合酶PAL基因的啟動子。Keller等以427bp GRPI.8啟動子驅(qū)動GUS基因,發(fā)現(xiàn)GUS

8、基因在轉(zhuǎn)基因煙草中呈維管束特異表達9。曾慶銀克隆了銀杏木質(zhì)部特異定位表達基因啟動子并在煙草中進行了功能研究,初步證明銀杏GRPI.8基因啟動子具有韌皮部表達特性10。Christensen等從擬南芥cDNA文庫和基因組文庫中克隆了4種pfn基因,即pfn1、pfn2、pfn3、pfn411。劉昱輝等在對pfn2啟動子作5端缺失分析中發(fā)現(xiàn),-1667-1bp pfn2全長啟動子驅(qū)動GUS基因在轉(zhuǎn)基因伽藍菜的根、莖、葉中均呈維管束特異表達12。Bevan等在轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯中發(fā)現(xiàn),菜豆PAL2啟動子(全長1200bp驅(qū)動GUS基因在莖的木質(zhì)部、皮層、表皮細胞、根尖、花瓣著色區(qū)和花粉粒中均有特異表

9、達13。1.4塊莖特異表達啟動子(tuber specific promoter馬鈴薯GBSS基因在各器官中均有表達,但在塊莖與匍匐莖中最高。經(jīng)研究表明馬鈴薯GBSS基因啟動子驅(qū)動的GUS基因在匍匐莖和塊莖中的表達比葉片高125350倍,且高濃度蔗糖等因素可誘導GBSS基因高水平表達14。宋東光利用分離到的馬鈴薯匍匐莖尤其是塊莖中高水平的patatin啟動子將乙肝表面抗原基因構(gòu)建于patatin啟動子調(diào)控之下,使乙肝表面抗原基因在馬鈴薯中得到高表達15。此外,Molnara等研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯塊莖StMCPI和SbM-CPI啟動子都具有塊莖和漿果器官特異性16。1.5根特異表達啟動子(root t

10、issue specific promoter根是植物體吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官,根特異表達系統(tǒng)可用于研究植物的高滲脅迫耐受、植物修復(fù)和根際分泌等。Borisjuk等用根特異啟動子mas2、GFP和煙草鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin基因構(gòu)建融合表達載體,轉(zhuǎn)基因煙草水培研究結(jié)果表明,根細胞不僅能夠高效產(chǎn)生GFP,而且可將目的蛋白質(zhì)分泌到液體培養(yǎng)基中17。此外,應(yīng)奇才等運用松樹根特異性啟動子PmPgPR10驅(qū)動CMO/BADH雙價基因并轉(zhuǎn)入水稻,對轉(zhuǎn)基因植株根和葉的CMO 酶、BADH酶活性及其它生理生化指標進行了測定,結(jié)果表明:CMO/BADH雙價基因可在根部特異性表達18。2生殖器官表

11、達的特異性啟動子2.1花粉組織特異性啟動子(pollen specific pro-moter花粉發(fā)育相關(guān)的組織特異性啟動子在花粉發(fā)育過程中起到重要作用。花粉發(fā)育有關(guān)的組織特異性啟動子如TA29,Lat52,Osg6B,Zm13,S1等得到了較詳細研究。Mariani等將煙草花藥絨氈層特異表達基因啟動子TA29與核酸酶基因Barnase、RnaseT1融合后轉(zhuǎn)化植物,核酸酶基因在花藥中特異表達,并破壞絨氈層,獲得雄性不育煙草和油菜19,20,目前已在煙草、玉米、油菜、擬南芥、水稻等植物上應(yīng)用并獲得成功。Bate等在西紅柿中發(fā)現(xiàn)了Lat52基因,該基因在花粉成熟時首先在花粉的營養(yǎng)細胞中表達21。

12、Bp4基因家族是從甘藍型油菜中分離得到的,為花粉特異表達,Zm13啟動子為玉米的花粉特異啟動子,從擬南芥中分離得到的A9的啟動子也可以驅(qū)動該基因在花藥絨氈層特異表達。多基因家族Profilin是高等植物中的一類低分子量的肌動蛋白結(jié)合蛋白,在不同的條件下調(diào)節(jié)細胞內(nèi)肌動蛋白骨架的聚合和解聚。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)有五種Profilin(PRF,其中PRF1,PRF2,PRF3為組成型表達基因,在所有生長細胞中均呈強表達而222007年第6期PRF4,PRF5則為花粉特異性表達,成熟花粉以外的細胞包括小孢子中均無表達22。2.2花器官特異表達啟動子(flower specific pro-moter就花卉育

13、種技術(shù)來說,花卉的品種和色澤是育種中最為關(guān)鍵的因素。對花器官特異表達啟動子的研究可克服傳統(tǒng)育種技術(shù)選育稀有花色品種的難度大等問題。UBC6基因是從擬南芥中分離出來的編碼一種與泛素連接酶(ubiqutin conjucting enzymes同源的基因,Watts等通過將UBC6啟動子與GUS 基因融合轉(zhuǎn)入擬南芥的研究表明:該基因主要在花和種子中表達,在裂開前的成熟花藥、萼片和授粉后的花柱,以及花絲頂端的維管組織和心皮中均能表達23。苯丙氨酸裂解酶(phenyl alanine ammonialyase,PAL基因啟動子,輔酶A連接酶(4 coumarate:coenzyme A ligase,

14、4CL基因啟動子和CHS基因啟動子是與苯丙酮(phenyl propanoid代謝關(guān)鍵酶基因的啟動子,研究表明在各種花器官中都能夠有效地驅(qū)動GUS基因的表達,尤其是花瓣中具有很強的表達特性24,25。另外,Annadana等克隆了菊花UEP1啟動子并與4個異源啟動子(矮牽牛的chs2A和EPF225,擬南芥的CER6以及馬鈴薯的PMC比較發(fā)現(xiàn):UEP1啟動子在傘形花序和花盤小花的花瓣中表達量最高,是CaMV35S啟動子的50倍26。馬沁沁等從秈稻川75A(Oryza sativa L黃化苗葉片中獲得水稻花藥絨氈層特異表達的啟動子Tsp1,序列分析發(fā)現(xiàn),該片段與Osg6B啟動子同源性為96%,且

15、具有真核生物啟動子的多種特征序列,該啟動子為水稻花藥絨氈層特異表達的啟動子27。2.3果實特異表達啟動子(fruit specific promoter植物的發(fā)育是基因時空調(diào)控表達的結(jié)果,而這一過程往往通過激素的變化來實現(xiàn)。乙烯在果實成熟過程中起重要作用,它通過信號傳導系統(tǒng)協(xié)調(diào)與相關(guān)基因的表達,使果實色、香、味和質(zhì)地發(fā)生改變直至成熟。植物果實相關(guān)基因啟動子一般與乙烯形成有關(guān),研究比較深入的有E4、E8、PG、2A12基因的啟動子與ACC合酶啟動子。E4基因是與果實成熟相關(guān)的乙烯應(yīng)答基因,其近端區(qū)161bp就可使基因表現(xiàn)出果實成熟時乙烯誘導的特性,乙烯應(yīng)答區(qū)被定位在-161-85的區(qū)段內(nèi)28;E

16、8基因?qū)儆诠麑嵆墒煺{(diào)控類基因,其啟動子在葉中表達較弱,在花藥和果實中高水平表達,該啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點前-409-263序列為成熟調(diào)控區(qū),是在成熟過程中表達所必需的29;因此,E4、E8基因啟動子的作用是各自獨立的,皆具有果實成熟信號誘導元件和乙烯誘導元件。多聚半乳糖醛酸酶(PG基因通常在非成熟果實中不表達,在果實成熟過程起始后其mRNA才可被檢測到。該基因5上游231bp的區(qū)段為最小的成熟誘導啟動子,推測在-231-134及-806-433區(qū)段之間分別有一個正調(diào)控區(qū),負責基因在外果皮細胞和內(nèi)果皮細胞中表達,與E8基因啟動子序列相比,無明顯的同源性。類似的研究還有番茄PG基因啟動子和蘋果PG基因

17、啟動子,它們驅(qū)動基因在果實成熟時特異性表達。多基因家族編碼的ACC合成酶在乙烯的產(chǎn)生過程中起調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)已從番茄、綠豆、蘋果、康乃馨、馬鈴薯、獼猴桃、筍瓜、小西葫蘆等植物中分離到ACC合成酶基因30。王新力等發(fā)現(xiàn)香蕉ACC合成酶基因的啟動子與番茄E4、E8、PG基因啟動子相似性只有25%,同時也沒有番茄E4、E8啟動子中的E4/E8蛋白結(jié)合位點及乙烯應(yīng)答元件31。此外,哈斯阿古拉等應(yīng)用PCR方法從甜瓜基因組中擴增出甜瓜類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶(即黃瓜素, cucumisin基因自轉(zhuǎn)錄起始位點至上游310bpDNA 片段,序列分析表明該序列與已報道的相應(yīng)序列完全相同,具有TATA-box、CAAT

18、-box、G-box、I-box-like和增強子元件TGTCACA等功能域,具有典型的果實特異性啟動子特征32。2.4種子特異表達啟動子(seed specific promoter種子特異表達啟動子是利用用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得果實無核性狀的關(guān)鍵。利用種子特異性啟動子與影響種子形成的相關(guān)基因融合,如生長素合成酶基因、細胞分裂素基因等,使其在種子發(fā)育初期大量表達,從而影響種子形成,或與核酸酶基因融合,專一性阻斷種子發(fā)育的某一進程,最終導致果實無核性狀。Rotino等將子房特異性表達啟動子DefH9與IaaM基因(IAA合成酶基因融合,并將其導入茄子和煙草中,單性結(jié)實株率達50%,且座果率多數(shù)在90%

19、以上,該試驗說明,運用轉(zhuǎn)基因技術(shù),在子房中專宋揚等:植物組織特異性啟動子研究23生物技術(shù)通報Biotechnology Bulletin2007年第6期一性地表達生長素合成酶基因,能誘導單性結(jié)實33。種子貯藏蛋白是人類食用蛋白的重要來源之一,而這些基因的表達受到嚴格的時間和空間調(diào)節(jié)。由于我國大部分小麥品種的蛋白中缺少小麥麥谷蛋白5亞基,從而直接影響到面包的烘烤品質(zhì)。Chen等通過PCR擴增獲得了小麥麥谷蛋白5亞基結(jié)構(gòu)基因(sub5及其啟動子(Psub5序列,得到了含有目的基因的表達載體,希望通過基因工程的方法將該表達載體用于小麥的品質(zhì)改良34。棉花的蕾、花、鈴等生殖器官是害蟲危害的主要器官,由

20、于目前轉(zhuǎn)基因抗蟲棉所用的啟動子都是CaMV35S啟動子,它所驅(qū)動的殺蟲基因在棉花的根、莖、葉中表達量較高,而在棉花的蕾、花、鈴等主殖器官中的表達量較低,致使目前轉(zhuǎn)基因抗蟲棉出現(xiàn)“前期抗蟲性高,后期抗蟲性下降”的生產(chǎn)實際問題。任茂智等分離的棉花Nodulin-like瘤素(Nodulin蛋白和腺普酸核糖基化作用因子arf1兩個啟動子,具有較強的啟動活性和組織器官特異性,Nothern blot,、GUS組織化學分析和GUS熒光定量分析結(jié)果表明這兩個啟動子能夠驅(qū)動基因在棉花的蕾、花、鈴等生殖器宮中高效表達35。此外,Digeonj用IPCR的方法克隆了小麥puroindo line基因的啟動子36

21、。Vincent等也率先獲得了柏樹PtNIP1基因的胚胎發(fā)育特異性啟動子37。這些啟動子的調(diào)控不僅受到組織細胞生理狀態(tài)和化學物理信號等物質(zhì)的誘導,還受到發(fā)育階段的調(diào)控,其表達是多種因素相互作用的結(jié)果。例如,豌豆胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制子基因啟動子的種子特異表達還受到干旱脅迫的誘導38。在組織特異性啟動子調(diào)控下,基因的表達常常只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位,并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展,這一特性必然使組織特異型啟動子作為一種重要的順式作用元件在生物反應(yīng)器,選育抗蟲、抗病、抗旱、抗高滲脅迫等抗逆特性的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)良品種等領(lǐng)域得到更加廣泛的應(yīng)用。參考文獻1楊予濤,等.中國科

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