人脂肪干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定-2019年文檔

1、人脂肪干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2011.08.004組織工程的一個研究重點， 是種子細胞的來源。 研究發(fā)現(xiàn)脂 肪組織含有一種被稱為 ADSCS勺細胞，它具有一般干細胞的特 性，與骨髓干細胞相比，它具有明顯優(yōu)勢，在來源、取材、擴增 能力方面， 都是骨髓干細胞所無法比擬的， 可作為種子細胞應用 于組織工程。材料與方法試劑與儀器：低糖DMEI培養(yǎng)液，1型膠原酶，胎牛血清， PBS緩沖液，0.25%胰蛋白酶，恒濕培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，細胞 計數(shù)儀，流式細胞儀， 低速水平離心機， 超凈工作臺， CD29、CD44、 CD105。脂肪組織來源： 實驗所

2、用成人脂肪組織來自蚌埠醫(yī)學院第一 附屬醫(yī)院抽脂術(shù)的健康女性，年齡 2545歲。脂肪干細胞的原代培養(yǎng)：無菌條件下提取脂肪組織約15g，PBS液洗去紅細胞。眼科剪剔除脂肪組織中可見血管，剪碎至細 小顆粒，0.1% I型膠原蛋白酶消化，1500r/分離心10分鐘，去 除脂肪細胞及上清液， D-hanks 液重懸沉淀， 200 目細胞篩過濾， 1500r/ 分離心 10 分鐘，所得細胞提取物用含 15%胎牛血清的高 糖DMEM培養(yǎng)液重懸，以適當密度接種于無菌培養(yǎng)瓶中， 在37C、 CO2體積分數(shù)為5%飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育，5天后首次換液， 之后 3 天換液 1 次，待原代細胞達 85%融合時消化傳代

3、。脂肪干細胞的傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)細胞達到85%融合時，以0.25%胰蛋白酶將貼壁細胞消化分離 35分鐘，1 ：2進行傳代， 接種于 25ml 培養(yǎng)瓶中， 3 天換液 1 次，當貼壁細胞接近融合時 再次傳代。光學顯微鏡下觀察細胞生長及形態(tài)。流式細胞儀檢測相關(guān)抗原： 流式細胞儀對第 3 代脂肪干細胞 表面相對特異性抗原進行檢測。 0.25%胰蛋白酶消化待檢細胞，1500r/分離心10分鐘，在細胞沉淀中（細胞數(shù)量約 1X 106）分別加入FITC-CD44熒光抗體，PE-CD29熒光抗體，APC-CD105熒 光抗體各20卩l(xiāng) , 4C孵育30分鐘，再用PBS緩沖液清洗2遍， 最后用 10%福爾馬林

4、固定細胞，上機測定抗原的陽性率。結(jié)果脂肪干細胞的形態(tài)：將有脂肪干細胞貼壁的培養(yǎng)瓶口旋緊， 水平放置在倒置顯微鏡下觀察，在原代細胞培養(yǎng) 24小時后可見 少量較大的呈梭形的脂肪干細胞貼壁， 4天首次換液，細胞清晰 可見，呈多角形、紡錘形，集落樣生長。 9 天后細胞生長明顯增 加，呈渦旋狀生長。從原代培養(yǎng)到第 1 4天時可見細胞鋪滿瓶底 80%左右。而傳代細胞生長速度明顯快于原代細胞。傳代后細胞增殖明顯加快，于第 3 天開始數(shù)量明顯增多， 56 天后細胞即 已長滿培養(yǎng)瓶底，細胞排列更加整齊有序，雜質(zhì)細胞極少見。見 圖 1 、2。脂肪干細胞的表型特征： 流式細胞儀分析第 3 代的脂肪干細 胞的細胞表型

5、，CD29陽性率為86%± 2% CD44陽性率為93%± 1% CD105陽性率為78%±2%見圖3。討論脂肪干細胞的鑒定， 尚無直接的方法。 一般通過培養(yǎng)過程中 出現(xiàn)的分化表型逆推得知。研究證實多種干細胞皆可表達CD44，用免疫組織化學方法檢測細胞 CD4 4陽性表達，表明細胞源自干 細胞1。免疫熒光和流式細胞術(shù)檢測顯示， CD29、CD44、CD105、 CD13是間充質(zhì)干細胞的特征性表面標志。它們在脂肪干細胞中 陽性表達說明脂肪干細胞具有間充質(zhì)干細胞表型2。圖 3 脂肪干細胞的表型特征陶凱等 3通過不同血清濃度作用下生長曲線繪制發(fā)現(xiàn)， 在血清濃度為 15%和 20%時，在最短時間內(nèi)細胞可進入平臺期， 達到細胞增殖高峰期，綜合考慮性價因素，實際應用中可將 15% 作為血清的最適宜濃度。 通過兩代生長曲線發(fā)現(xiàn)， 第 2代細胞較 原代細胞更快進入增殖高峰，即細胞在最初傳代后，生長加快， 與實際培養(yǎng)中所見的適度傳代促進增殖相一致。 筆者在實驗過程 中也得到了相似的結(jié)論。 需要強調(diào)