(完整word版)酶聯(lián)免疫吸附測定法

1、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)1. 定義32. 原理32.1 抗原抗體反應32.2 免疫測定在臨床檢驗中的應用53. ELISA 的類型53.1 雙抗體夾心法測抗原：63.2 雙抗原夾心法測抗體63.3 間接法測抗體63.4 競爭法測抗體73.5 競爭性測抗原73.6 捕獲包被法測抗體73.7 ABS-ELISA 法84ELISA試劑的組成94.1 固相載體：94.2 包被的方式94.3 包被用抗原：天然抗原、重組抗原、合成多肽抗原104.4 包被的條件,104.5 洗滌液： 104.7 爾的催化性； 114.8 結合物的制備114.9 結合物的保存124.10 酶的底物124.11 酶反應

2、終止液124.12 參考標準品134.13 加樣：134.14 保溫134.15 保溫方式：134.16 室溫溫育的反應134.17 洗滌144.18 顯色144.19 比色144.20 酶標比色儀154.21 結果判定154.22 定量測定164.23 ELISA的操作要點161.定義酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay),簡稱ELISA,采用抗原與 抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶打底物產(chǎn)生顏色反應，對受檢物質(zhì)進行定性 或定量分析的一種檢測方法。2.原理采用抗原勺抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，可對

3、受檢物質(zhì)的定性或定量分析。2.1抗原抗體反應2.1.1 可逆性抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)半衡，其反應式為：Ag+Abf AgAb抗體的親和力(affinity),可以用平衡常數(shù)K表示：K=Ag Ab AgAb, Ag Ab的解 離槿度與K值有關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩 者結介牢固，不易解離。解離后的抗原和抗體均能保持原有的結構和活性。2.1.2特異性抗原抗體的結合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結合位點之間?；瘜W結構和空間構型互補 關系，具有高度的特異性。因此，在很參時候，測定某一特定的物質(zhì)不需分離待測物。 2.1.3 最適比例只冇當抗原

4、抗體的濃度比例是當時，才出現(xiàn)可見反應。以沉淀反應為例(Ab最固定，Ag最遞増)圖(1)該理論的支持者網(wǎng)格學說，其成立的三個條件： 抗原多價，抗體雙價； 二則比例合適； Ag/Ab 過剩。當抗原抗體濃度比例合適時，抗體的兩個Fab段分別結合兩個Ag分子，相互交叉結合 連接成巨人的網(wǎng)格狀立體聚合物，沉淀可見，如圖b,Ab/Ag過剩時，過剩方的結合價得不到飽和，大多數(shù)游離存在，只形成小分子復合物, 沉淀不町見，如圖a, c, doPrecipitating complexesI I5_9，)_C11IT I少/ Anfibody excess牙/Equivole neeSoluble complex

5、es)(Antigen excess少/Monovalent hapten圖2.1.4 敏感性化學比色法的敏感度為mg/mL水平；酶反應測定法的敏感度約為5-10 u g/mL：免疫測 定中凝膠擴散法和濁度法的敏感哎與酶反應相仿；標記的免疫敏感庚可提高數(shù)千倍，達 ng/mL水平。如HBsAg,其敏感度可達O.lng/mLo2.2免疫測定在臨床檢驗中的應用由于各種抗原成分,包括小分子的半抗原，均町用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體, 利用此抗體作為試劑就町測試標本中的抗原，因此免疫測定的應用范闌極廣。3. ELISA的類型ELISA可用于測定抗原，也町用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試

6、劑： 免疫吸附劑：固相的抗原或抗體； 結合物：酶標記的抗原或抗體；底物：酶催化的此物。常見的檢測方法冇：雙抗體夾心測抗原、3.1雙抗體夾心法測抗原:圖(3)此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等人分子抗原，例如HBsAg、HBeAg. AFP等。只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體.就町以用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。3.2雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原進行包被和制備酚標結介物。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定, 因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關鍵在于 酶標抗原的制備，應根據(jù)抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。3 3間接法測抗體nmTl 仏忑1姿事

7、比糸鸚肆”W 畀止碩Ih_r cJ間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就町利用同一酚標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。3.4競爭法測抗體圖（4）當抗原材料屮的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，町用此法檢測特異 性抗體。3.5競爭性測抗原小分子抗原或半抗原缺乏町作為夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進 行測定，町以采用競爭法模式其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體 結合。標本中的抗原含量越多，結合在固相上的酶標抗原越少，繪后顯色也越淺。小分子激 素、藥物等多用此法。3.6捕獲包被法測抗體塚質(zhì) 頁加 J卜” 卜”以IgM抗體為例。血清中針對某些抗原的特異性IgM常和

8、非特異性IgM,以及特異性IgG 同時存在，后者會干擾IgM的測定。捕獲法則較好地解決了上述問題.其原理是先用抗人IgM （ 鏈）抗體包被固相我體，使血清中所右IgM（包括特異性與非特異性IgM）均固定在固 相上.經(jīng)洗滌去除IgG后，再測定特異性IgM.此方法目前主要用于檢測以類早期感染的特異性抗體IgMc3.7 ABS-EUSA 法am冰廊風柿m細ABS為親和素（avidin）生物素（biotin）系統(tǒng)（system）的略語。親和素是一種糖蛋白, 分子量60000,每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子 量244o用化學方法制成的衍生物素疑基琥珀酰亞胺BSHfLj

9、蛋白質(zhì)和糖等多種類型的人小 分子形成生物素標記產(chǎn)物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性, 其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經(jīng)結合就極為穩(wěn)定。由于一個親和素町與4個生物 素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為葩標記親和素生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素 生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的 酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然后再加酶標記的生 物素以進一步提高敏感度。在早期，親和索從蛋清中提取，這種卵親和索為堿性糖蛋白，與 聚苯乙烯載體的吸附性很強，用于ELISA中可使本底增高。從鏈孫菌

10、中提取的鏈孫親和素則 無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由于ABS-ELISAK普通ELISA多用了兩種試劑， 增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA hZ用不多。4. ELISA試劑的組成ELISA試劑中令三個必要的組成部分：免疫吸附、結合物、酶的底物。常見的組成如下： 已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； 酶標記的抗原或抗體（結合物）： 酶的底物： 陰性對照品或陽性對照品，參考標準品；結介物及標本的桶釋液： 洗滌液： 酶反應終止液：4.1固相載體：聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍能保留原來的 免疫學活性。聚氯乙烯，對蛋白質(zhì)的吸附性能

11、比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板Z間、同-板各孔 之間、同一條各孔之間性能相近。4.2包被的方式將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結構上的疏水基 團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非簾特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、 等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常倉有更多的疏水基團，故更易吸 附到固相載體表面。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原，對用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固 相上的抗原純度人大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包

12、被法。親和素生物素，即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA,這種包被方法均勻、牢 固，已擴人應用于各種抗原物質(zhì)的定鼠測定。脂類物質(zhì)，無法與固相載體結合，可將其在右機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA 板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性也好，抗原用屋少，僅為直接包 被的1/10乃至1/100o4.3包被用抗原：天然抗原、重組抗原、合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決 定簇，純度高、特異性也高。但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián) 物

13、與固相戦體的吸附，間接地結合到固相載體表面。包被用抗體：IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)接發(fā)生在Fc段上，抗體結合點暴露于外。取材于抗血消或含單克隆抗體的培養(yǎng)液，須除去雜抗體后才能用于ELISA,以保證試驗 的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況卜，用多種單抗混合包被，町収得更好的效果。4.4包被的條件：Ph9.6碳酸鹽緩沖液；PH7.2磷酸鹽緩沖液；Ph7-8 Tris-HCI 緩沖液：加入包被液后，在4-8C冰箱屮放豐過夜，37C中保溫2小時。包被濃度隨我體和包彼 物的性質(zhì)可能有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一

14、般蛋白質(zhì) 的包被濃度為10ng/mL-20ug/mLc封閉:在包被后，用高濃度的無關蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉讓人最無關的蛋白質(zhì)充填這 些空隙，從而排斥ELISA后步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用的封閉劑:0.05%-05%BSA； 10%的小牛血清或1%明膠:脫脂奶粉,比較價廉，nJ 以用高濃度（5%）。4.5洗滌液：在板式ELISA中，常用的桶釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。46結合物:即酶標記的抗體（或抗原）是ELISA中關鍵的試劑。4.7酶的催化性；抗體（抗原）的免疫活性；含有或少含有游離的抗體（或抗原）；結介物要冇良好的穩(wěn)定性。結合物用的抗原和抗體制備結合物時所用純度較高的Ig

15、G,以免在打酶聯(lián)結時其他蛋白的干擾。放好用層析純 化的抗體，這樣全部酶結介物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結果 本地淺淡。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。酶純度高，催化反應的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標本 中不存在相同的酶。酶結介物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，冇色產(chǎn)物易于測 定等。在ELISA中有HRP,AP,葡萄糖氧化師，B O半乳糖tf酶和脈畫等。HRP是一種糖蛋白，含糖最約為18%,分子最為44000,是一種復合酶，由主酶（酶蛋 白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種嚇瞅蛋白質(zhì)。

16、4.8結合物的制備酶標記抗體的制備方法主要仃兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基酸通過它而聯(lián)結。 有效（結合率達60%-70%）和覓復性好。但是交聯(lián)反應是隨機的，結合物的大小不一，酶與 酶，抗體與抗體Z間也有可能交聯(lián)，影響效果。過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很 活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏而結合。簡單有效。結合物屮混令的游離酶-般不影響ELISA屮最后的酶的活性測定，但會與酶標抗體竟爭 相應的固相抗原，因此制備的酶結介物應予純化，去除游離的穂和抗體后用于檢測，效果更 好。制得結

17、合物，最適的工作濃度就是指結合物稲釋至這濃度時，能維護個低的本底, 并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。4.9結合物的保存酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一 年左右。結合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大 寄素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳汞，AP結合物可加疊氮鈉）。結合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結介物以配成工作液。為避免結介物在反應中直接吸附在固相載體上: 0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均己用合適的緩沖液配制成匸作液，使用時不需 再行稀釋，在40C保存期可達6個月。410酶

18、的底物1） HRP的底物EDH2+ H2O2D+ 2H2O匕式中，DH2為受氧體，H2O2為受氫體。DH2 一般為無色化合物，經(jīng)幽作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如鄰苯二胺（OPD）、四甲 基聯(lián)苯胺（TMB）和ABTS。OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，杲敏度 高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。TMB經(jīng)HRP作用后的產(chǎn)物顯藍色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，町配成溶液試劑，只需與H2O2 溶液混合即成應用液。酶反應終止后,TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量,最適 吸收波長為450nmoABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。H

19、RP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分子醇的過氧化物和尿素過氧化物。AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚， 在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一段時間。AP也有發(fā)熒光 底物（磷酸4甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。 4.11酶反應終止液常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的故終體枳而異，在板式ELISA 中一般采用2mol/Lo對照設定陽性對照品和陰性對照品是檢驗試驗仃效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照。陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相-致，多以含蛋白

20、保護劑的緩沖液為 基質(zhì)。加入的量應與試劑的敏感度想稱；在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質(zhì)的最。陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不町含HBsAg,最好抗HBs也是陰性.4.12參考標準品定量測定（如卬胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應含仃制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋町檢測范闈的4-5個濃度，一般均配入倉蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。標本的采取和保存體液、分泌物、排泄物等均町作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。以血清標本為例，血漿含有纖維蛋白原、抗凝劑，其他成份同血清。血消標本應避免溶血。紅細胞溶解時會釋放出只右過氧化物酶活性的物質(zhì)

21、，以HRP為 標記的ELISA測定中，可能會增加非特異性顯色?；静僮髯⒁獬鲰?13加樣：在ELISA中一般有3次加樣步驟，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。4.14保溫抗原抗體完全反應的保溫過程稱為溫育。ELISA M f固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表而上發(fā)生。溫育常常用的溫度有43C、37C、室溫和4C等，37C是實驗室中常用的保溫溫度，也 是人務數(shù)抗原抗體結合的合適溫度。415保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊、水浴。若用保溫箱：ELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布，故后將ELISA

22、板都放在濕紗布上。反應板均不宜疊放，以保證格板的溫度都能迅速平衡。416室溫溫育的反應操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范惘內(nèi)，標準室溫溫度是指在20-254C,但具體操作 時可根據(jù)說明書要求控制溫育。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。為保證這一 點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。417洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，卻也決定看實驗的成敗。ELISA洗滌:達到分離游離的和結介的酚標記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)， 以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等蜩料對蚩白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時 又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌卜來?？梢哉f，在ELISA操

23、作中，洗滌是最主要的關鍵孩術。洗滌的方式除某些ELISA儀器配N的特殊的自動洗滌儀外，手工操作月流水沖洗式和浸 泡式兩種。1）流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餉水，口來水。洗滌效果更為徹底, 且也簡便、快速。己冇實驗表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板 孔表面，洗滌效果更佳。2）浸泡式微最滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的 結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含有疏水基團，也含有親水基團，使蛋白質(zhì)回復到水溶 液狀態(tài)，從而脫離固相載體。418顯色顯色是幽催化無色的底物生成右色產(chǎn)物的溫育反應。反應的溫度和時間仍然是影響顯色

24、 的因素。在一定的時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適肖 提高溫度有助于加速顯色進行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中宜丁操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證試驗 結果的穩(wěn)定恂 最好在規(guī)定的適當時間閱讀結果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達頂 峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。4.19比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。以蒸13水校準零點，測量讀取底物孔（未經(jīng)任何反應僅僅添加底物溶液的孔）和空白孔 （以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后町用空 白孔以蒸ta水校準零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。結果以光密度（oplical density,OD）,先按規(guī)定用吸光度（absorbence,A）,兩者含義相同。 通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右卜角，如OPD的吸收波長為492nm,表示 方法為 “A492nm” 或 “OD492nm”。4.20 標比色儀酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指測讀ELISA光度計。針對固相載體形式不同，各有特制 的適用于板、珠和小試管的設計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、 復性、秸確度和町測呈;范用、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可以稍確到0.001,準確 性為1%,重復性達0.5%o操作時室溫