特異性的蛋白小分子熒光探針及其標(biāo)記技術(shù)_圖文

1、 文章編號(hào) :1004-0374(200801-0003-11特異性的蛋白小分子熒光探針及其標(biāo)記技術(shù) 陳磊,姚祝軍 *(中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200032摘要:活體蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)功能的可視化研究中。熒光蛋白常被用來(lái)研究 蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的表達(dá)和定位,但由于它本身體積比較大,往往會(huì)影響目標(biāo)蛋白的生物活性。特異 性的小分子熒光探針以其體積小、膜透性好、背景噪音低以及制備方便的優(yōu)點(diǎn)成為蛋白質(zhì)研究的一個(gè)有 力工具。本文將簡(jiǎn)要介紹近幾年來(lái)各類(lèi)特異性小分子蛋白熒光探針的研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞:蛋白質(zhì);特異性標(biāo)記;蛋白標(biāo)記;小分子熒光探針中圖分類(lèi)號(hào)

2、:Q51;Q816文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:BSmall-molecule fluorescent probes and their specific labeling protocols for proteinsCHEN Lei, YAO Zhu-jun*(State Key Lab of Bio-organic and Natural Products Chemistry, Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032,ChinaAbstract: Site-specificfl

3、uorescentlabelingofproteins invivo remainsoneofthemostpowerfultechniquesfor imagingcomplexprocessesinlivecells.Althoughfluorescentproteinsinavarietyofcolorsareusefultoolsfor trackingexpressionandlocalizationoffusionproteinsincells,theserelativelargetagcanperturbprotein folding,traffickingandfunction

4、.Site-specificsmall-moleculefluorescentprobewithadvantagesofsmallsize, membranepermeability,lowbackgroundandsimplepreparationwillbeanidealtoolinvariousstudiesofprotein functions.Thisarticlesummarizestheadvancesinselectivelabelingofproteinsbyusingsmall-moleculefluo-rescentprobesinrecentyears.Keywords

5、:protein;imaging;site-specificlabeling;small-moleculefluorescentprobe蛋白質(zhì)是細(xì)胞功能的主要執(zhí)行者。在許多情況 下,一個(gè)細(xì)胞功能的實(shí)現(xiàn)是多個(gè)蛋白質(zhì)分子相互作 用的結(jié)果。許多重要的生命過(guò)程,如多亞單位蛋白 質(zhì)復(fù)合體形成、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、蛋 白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)修飾和降解等,都依賴(lài)于蛋白質(zhì) 之間相互作用。因此,研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能 及其相互作用是理解細(xì)胞生命過(guò)程中各種內(nèi)在機(jī)制 的關(guān)鍵。近年來(lái),隨著蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展與成 熟,對(duì)蛋白質(zhì)的研究進(jìn)入了一個(gè)高速發(fā)展的階段。 蛋白熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、動(dòng)態(tài)響 應(yīng)范圍

6、寬以及測(cè)定條件更接近生命體的生理環(huán)境的 優(yōu)點(diǎn),并且能夠?qū)崿F(xiàn)活體可視化分析,它在蛋白質(zhì) 分析中得到了廣泛應(yīng)用。1天然蛋白熒光探針 綠色熒光蛋白(GFP 談到蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記,在這里不得不提一個(gè) 具有里程碑意義的事件綠色熒光蛋白(greenfluo-rescentprotein,GFP 1及其變體(如CFP,YFP等的 發(fā)現(xiàn)和它們?cè)诟鞣N細(xì)胞事件的實(shí)時(shí)可視化研究中的 應(yīng)用 2。作為一種良好的天然蛋白質(zhì)熒光探針, GFP 具有操作簡(jiǎn)單,不需要任何外加底物或輔酶因收稿日期:2007-10-29;修回日期:2007-11-27基金項(xiàng)目:“973”項(xiàng)目(2002CB0713808;國(guó)家自然 科學(xué)基金杰出青年

7、基金(20425205*通訊作者 :E-mail:yaoz4生命科學(xué) 第 20卷子,表達(dá)幾乎不受種屬范圍的限制,易于得到性質(zhì) 不同的突變體,具有特異性高、熒光穩(wěn)定、無(wú)毒 害性等優(yōu)點(diǎn);但是由于 GFP 體積較大(由 238個(gè)氨 基酸組成,它在活體標(biāo)記中可能會(huì)影響被標(biāo)記的 蛋白質(zhì)或細(xì)胞的正常生理功能 3,4, 而且它的中等光 穩(wěn)定性也限制了它在單分子研究中的應(yīng)用 5。小分 子熒光探針以其立體位阻小、量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性 強(qiáng)、標(biāo)記速度快并且能夠提供除了熒光之外的讀出 的優(yōu)點(diǎn),成為更理想的蛋白質(zhì)熒光探針 6-8。 2小分子蛋白熒光探針的發(fā)展根據(jù)研究體系的需要,蛋白熒光探針對(duì)蛋白質(zhì) 的標(biāo)記可以分為定點(diǎn)熒光

8、標(biāo)記和非定點(diǎn)熒光標(biāo)記。 非定點(diǎn)的熒光標(biāo)記一般是通過(guò)目標(biāo)蛋白上一些裸露的 氨基、巰基或羥基與一些帶有活性反應(yīng)基團(tuán)的熒光 試劑(FITC、羅丹明綠、E-118、DTAF、Alexa488、 mBBr、5-IAF、Cy3TM 反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)(圖 1。經(jīng)實(shí)踐 證明,這些方法在目標(biāo)蛋白的可視化及示蹤檢測(cè)中 是有效的 9-11,但是,本身不具備專(zhuān)一的化學(xué)選擇 性,有的甚至?xí)⒓?xì)胞破壞。在一些復(fù)雜的體系 中,如研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,酶與底物之間 的相互作用以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,特別是利用 FRET 技術(shù)來(lái)研究蛋白質(zhì),用前面所提到的一些常 規(guī)的方法就無(wú)法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白特異性地定點(diǎn)標(biāo)記, 且無(wú)法保證被標(biāo)記的蛋白保

9、持其原有的活性,這就 更需要發(fā)展一類(lèi)特異性的小分子蛋白熒光探針來(lái)定 點(diǎn)標(biāo)記蛋白。特異性的小分子蛋白熒光探針一般包括兩個(gè)部 分:有機(jī)小分子熒光團(tuán)和對(duì)目標(biāo)蛋白具有特別專(zhuān)一 性識(shí)別作用的特定配體或是化學(xué)官能團(tuán)。通過(guò)基因 工程的手段對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行簡(jiǎn)潔的修飾,融入一個(gè) 能與熒光探針上的配體或是官能團(tuán)發(fā)生專(zhuān)一高效作 用(成鍵相互作用或是非成鍵相互作用的接受體,通過(guò)兩者的相互作用實(shí)現(xiàn)蛋白的定點(diǎn)熒光標(biāo)記。受 體配體的相互作用一般包括半抗原-抗體、 生物素-抗生物素、酶 -底物、雙砷染料 -四半胱氨酸標(biāo)簽 體系、 熒光團(tuán)-鎳離子-六組氨酸標(biāo)簽體系和細(xì)胞友 好的化學(xué)連接反應(yīng)?，F(xiàn)將從小分子熒光探針和目標(biāo)蛋白的融合方

10、式 來(lái)分別介紹近年來(lái)各類(lèi)特異性蛋白熒光探針的發(fā)展 情況。2.1通過(guò)共價(jià)成鍵連接方式實(shí)現(xiàn)的蛋白熒光標(biāo)記 2.1.1正交有機(jī)化學(xué)反應(yīng)在蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記中的應(yīng) 用2.1.1.1雙砷染料-四半胱氨酸標(biāo)簽體系Griffin等 12發(fā)展了一種很有前途的活細(xì)胞單分子標(biāo)記方法。這 種方法所用的熒光標(biāo)記探針為一類(lèi)能夠穿透細(xì)胞膜 和含有雙砷基團(tuán)的熒光分子(如 FlAsH-EDT 2。雙砷 熒光標(biāo)記分子進(jìn)入細(xì)胞后,與連在重組目標(biāo)蛋白質(zhì) 末端的六肽標(biāo)簽 CCXXCC 序列(簡(jiǎn)稱(chēng) TC,其中 X 是 除了半胱氨酸以外的其他氨基酸特異作用,生成 強(qiáng)熒光的共價(jià)結(jié)合的雙砷-四半胱氨酸體系(熒光強(qiáng) 度約為 FlAsH-EDT 2

11、的 50000倍。在這個(gè)體系中, 活細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白能夠被可透膜的雙砷染料特 異性標(biāo)記(圖 2 。在這個(gè)體系中加入的乙二硫醇 (EDT是一種解毒劑,它能夠保護(hù)內(nèi)源性的半胱氨 酸對(duì),同時(shí)使染料在遇到最終的 TC 靶之前保持不 發(fā)熒光。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出可產(chǎn)生藍(lán)色(ChoXAsH、綠色 (FlAsH或紅色熒光(ReAsH的雙砷染料。其中,基 于羅紅素開(kāi)發(fā)的紅色標(biāo)記染料 ReAsH 特別有用。如 用不同的雙砷染料進(jìn)行的程序標(biāo)記可以指示蛋白質(zhì) 分子的生長(zhǎng)期 13。鈣調(diào)蛋白(CaM 14是一種 Ca 2+結(jié) 合蛋白?；罴?xì)胞中 C 端帶有 TC 標(biāo)簽的重組鈣調(diào)蛋 白(CaM-TC被 BarNile-EDT

12、2特異性地標(biāo)記后,它的 圖1常用的蛋白熒光標(biāo)記試劑5 第 1期 陳磊,等:特異性的蛋白小分子熒光探針及其標(biāo)記技術(shù) 構(gòu)象因?yàn)?Ca 2+的濃度發(fā)生變化,相應(yīng)地引起熒光強(qiáng) 度的變化。Tsien 等將人體 GPCR 蛋白 A 2A 用 CFP(C 端和 FlAsH 標(biāo)記(位于細(xì)胞內(nèi)的第三個(gè)環(huán)處,通過(guò)檢測(cè) 兩個(gè)熒光團(tuán)之間的 FRET 效應(yīng)來(lái)監(jiān)測(cè)它的構(gòu)象變化 以及在細(xì)胞內(nèi)的激活過(guò)程:而同樣的研究思路用 CFP 和 YFP 組合代替上述的 CFP 和 FlAsH 組合就得 不到滿意的結(jié)果,而且影響了 A 2A 蛋白的 AMP 信號(hào) 傳導(dǎo)。雙砷染料不僅可以與蛋白質(zhì)的 N-端和 C-端相 結(jié)合, 它也能融入到

13、蛋白質(zhì)的內(nèi)環(huán)或是 -螺旋的外 表面,并且基本不影響目標(biāo)蛋白的生物活性。它已 經(jīng)被用于研究酵母菌的微管蛋白 3、受體與 G 蛋白 的相互作用 4、染色體的移位 15以及細(xì)菌在真核細(xì) 胞中分泌的病原體蛋白 16。FlAsH-EDT 2對(duì)蛋白的標(biāo) 記還可以實(shí)現(xiàn)蛋白的親和作用純化,熒光團(tuán)協(xié)助的 光失活 17(FALI,而這是 GFP 無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。由于 雙砷染料和目標(biāo)蛋白是牢固的共價(jià)結(jié)合,這種標(biāo)記 策略被用于蛋白的脈沖跟蹤多色連續(xù)標(biāo)記 18,在這 樣的實(shí)驗(yàn)中可以研究多蛋白復(fù)合體的組裝、轉(zhuǎn)移及 其動(dòng)力學(xué)機(jī)制。由于雙砷染料結(jié)構(gòu)上的特殊性(分子設(shè)計(jì)時(shí)既要 考慮分子本身的熒光性質(zhì),又要兼顧它與 TC 標(biāo)簽 的反

14、應(yīng)性,目前能夠被應(yīng)用于生物體系的染料僅 僅局限于兩類(lèi)分子骨架:熒光素和羅紅素?；跓?光素骨架的氟代雙砷染料也被用于生物體系 19;而 具有高亮度和光穩(wěn)定性的羅丹明還不能直接改造成 為理想的雙砷染料。 Bhunia和Miller 20發(fā)展了一種 通用制備方法,能夠?qū)⒁恍┏Ｒ?jiàn)的有機(jī)熒光小分子 轉(zhuǎn)變?yōu)殡p砷染料。他在常見(jiàn)的熒光素雙砷染料母體 上進(jìn)行合理的化學(xué)修飾連上所需的其他熒光團(tuán),成 功制備了一系列具有不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的新型雙砷 染料,并進(jìn)行了體外蛋白標(biāo)記的研究(圖 3。雙砷染料 -四半胱氨酸標(biāo)記體系具有背景噪音 低、母體蛋白功能影響小、熒光團(tuán)共價(jià)連接牢固等 優(yōu)點(diǎn),并且整個(gè)體系可以通過(guò)電子顯微鏡監(jiān)

15、測(cè)。雙 砷染料體系也存在一些缺點(diǎn),當(dāng)雙砷染料用于含有 較多半胱氨酸殘基的體系,它存在非特異性的連接 作用,而且這樣的作用沒(méi)法簡(jiǎn)單地通過(guò)加入過(guò)量的 乙二硫醇避免,所以檢測(cè)的背景熒光較高。為了減 少非特異性的連接作用,Hoffman 等 4在原有的標(biāo) 簽的兩側(cè)連上了特定的氨基酸,得到了一個(gè)新的標(biāo) 簽(FLNCCPGCCMEP ,大大增加了它與 ReAsH 的 特異性連接。此外,目標(biāo)蛋白上 TC 標(biāo)簽中的半胱 氨酸必須處于還原態(tài),所以它比較適合應(yīng)用在處于 還原環(huán)境的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,而在氧化環(huán)境中, 如分泌器通道或是細(xì)胞膜則無(wú)法發(fā)揮其作用。 2.1.1.2Staudinger-Bertozzi反應(yīng)經(jīng)

16、典的Staudinger 反應(yīng)是一個(gè)疊氮化物和膦生成氮葉立德(aza-ylide的 反應(yīng)。氮葉立德在水的存在下可以自發(fā)生成一個(gè)胺 和一個(gè)膦氧化物。這個(gè)反應(yīng)具有化學(xué)專(zhuān)一、產(chǎn)率 高、與水相容以及細(xì)胞環(huán)境友好等特性。Bertozzi 小組對(duì)上面的反應(yīng)給予一定修飾,使之生成一個(gè)酰 胺鍵而不是產(chǎn)生胺 21(圖4A。 他們小組證明了這些 改良的Staudinger反應(yīng)能夠在jurkat細(xì)胞表面很好地 進(jìn)行:將 jurkat細(xì)胞放在含疊氮乙酰甘露糖胺的培 養(yǎng)液中生長(zhǎng),疊氮基團(tuán)可以通過(guò)唾液酸生物合成途 徑引入到細(xì)胞表面的糖蛋白上。此細(xì)胞和水溶性的 生物素化的膦作用,細(xì)胞上的疊氮基和膦反應(yīng)生成 一個(gè)穩(wěn)定的的肽鍵

17、,從而形成了非天然的生物素化圖2FlAsH-EDT 2對(duì)活細(xì)胞中含有四半胱氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)的定點(diǎn)標(biāo)記 圖3連有各種熒光團(tuán)的雙砷染料6生命科學(xué) 第 20卷的細(xì)胞表面,加入連有抗生物素的熒光探針,就實(shí) 現(xiàn)了細(xì)胞表面的可視化(圖4B。 Bertozzi等 22又將 上述的標(biāo)記策略運(yùn)用到老鼠細(xì)胞中。2.1.1.3Huisgen成環(huán)反應(yīng) Click反應(yīng)Kolb和 Sharpless 23則發(fā)展了另一類(lèi)水溶性的化學(xué)反應(yīng), 稱(chēng) 為點(diǎn)擊化學(xué)(ClickChemistry。 這類(lèi)反應(yīng)是在Cu(I 的催化下,末端炔和疊氮化物高產(chǎn)率的生成 1,4二取代的 1,2,3三唑(圖 5。反應(yīng)物和產(chǎn)物在諸 多化學(xué)物質(zhì)和反應(yīng)條件

18、下都能穩(wěn)定存在。該反應(yīng)的 高選擇性、水兼容性和高產(chǎn)率的特點(diǎn)使它在細(xì)胞生 物學(xué)研究中具有巨大的應(yīng)用前景。 最近, Cravatt小 組利用此反應(yīng),發(fā)展了一個(gè)兩步策略用于活細(xì)胞和 動(dòng)物體內(nèi)的蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記 24。Beatty等 25應(yīng)用Click反應(yīng)在 E.Coli 細(xì)胞中進(jìn)行 一個(gè)新合成蛋白的熒光標(biāo)記。他們通過(guò)改造 t-RNA 合成酶將含有末端三鍵的非天然氨基酸 Eth 或 Hpg (蛋氨酸和苯丙氨酸類(lèi)似分子(圖6引入到一個(gè)新合 成barstar蛋白中, 然后通過(guò)一個(gè)Cu(I催化的高效 的環(huán)化反應(yīng)將包含疊氮官能團(tuán)的 7-羥基香豆素326(形成三唑環(huán)后熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)連接到目標(biāo)蛋白 上,熒光顯微

19、鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)這種新合成的蛋白主要分 布在細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)體中。為了證明這一結(jié)論, Beatty等 25又將內(nèi)質(zhì)體分離出來(lái)進(jìn)行凝膠電泳分析, 發(fā)現(xiàn)其主要成分確實(shí)是標(biāo)記的barstar蛋白。 2.1.1.4天然化學(xué)鏈接反應(yīng)Wieland小組和Brenner 小組第一次完整地建立了利用天然化學(xué)鏈接反應(yīng)的 化學(xué)體系,并于 1994年被 Dawson 小組證明其是天 然蛋白質(zhì)半合成的通用方法(圖 7。這個(gè)反應(yīng)的重 要特征是它的高化學(xué)選擇性, 它只發(fā)生在肽的 N-端 半胱氨酸殘基上,即使其他未保護(hù)的邊鏈的內(nèi)部含 有半胱氨酸殘基也不會(huì)干擾。Yeo 等 27將含有半胱氨酸氮端的目標(biāo)蛋白通過(guò) 內(nèi)蛋白介導(dǎo)的蛋白剪接在

20、活細(xì)胞中表達(dá)后,與含有 硫酯的小分子熒光探針發(fā)生天然鏈接反應(yīng),從而得 到了所需的熒光標(biāo)記蛋白。只有很少一些內(nèi)源性的 含N-端半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)存在于各種各樣細(xì)菌 和哺乳動(dòng)物的基因庫(kù)中,這使得基于天然鏈接反應(yīng) 的標(biāo)記方法可在不同的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中得到應(yīng)用。 2.1.1.5Diels-Alder反應(yīng)Diels-Alder反應(yīng)具有很高 的化學(xué)選擇性,尤其當(dāng)它在水相中進(jìn)行時(shí),它的反 應(yīng)速率和選擇性比在通常的有機(jī)相中還高。它的反 應(yīng)組分雙烯體和親雙烯體在細(xì)胞內(nèi)都是惰性的。因 此, Diels-Alder反應(yīng)可以作為一個(gè)理想的連接反應(yīng) 用于蛋白的熒光標(biāo)記。利用這個(gè)反應(yīng),Palomo 等 28實(shí)現(xiàn)了囊泡控

21、制酶 RabGTP 酶的定點(diǎn)熒光標(biāo)記, 并研究了它在REP-1蛋白以及異戊烯基轉(zhuǎn)運(yùn)酶的協(xié) 同作用下在細(xì)胞壁上的定位,得出的結(jié)論和以前 用 GFP 熒光標(biāo)記法是一致的。關(guān)鍵的 D-A反應(yīng)是 圖5Click反應(yīng)用于蛋白的標(biāo)記圖4Bertozzi-Staudinger反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理以及它在活細(xì)胞標(biāo)記中的應(yīng)用圖6連有末端三鍵的非天然氨基酸和疊氮香豆素7第 1期 陳磊,等:特異性的蛋白小分子熒光探針及其標(biāo)記技術(shù) 在 25,40µmol/L 蛋白濃度,24h 的條件下完成 的(圖 8。 2.1.2酶參與的細(xì)胞反應(yīng)在蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記中的應(yīng) 用2.1.2.1 AGT和受體組合熒光探針Johnsson等

22、 在研究人體 D N A 修復(fù)蛋白(h A G T ,相對(duì)分子質(zhì)量 25000,與 GFP 相近時(shí)(圖 9A,發(fā)現(xiàn)了一種新的 融合蛋白策略 29。它將 hAGT 蛋白融合到目標(biāo)蛋白 上,然后利用 hAGT 蛋白本身的活性(將 DNA 上的 氧上被烷基化的鳥(niǎo)嘌呤的烷基轉(zhuǎn)移到它本身的半胱 氨酸的硫原子上,在硫原子上進(jìn)行細(xì)胞友好的烷 基化反應(yīng),將標(biāo)簽分子連結(jié)到目標(biāo)融合蛋白上(圖 9B 。h A G T 蛋白能夠識(shí)別的鳥(niǎo)嘌呤底物類(lèi)型非常 多,其中以芐基鳥(niǎo)嘌呤衍生物最為常見(jiàn),到目前 為止,已經(jīng)有 20多種芐基鳥(niǎo)嘌呤底物被用于蛋白 標(biāo)記 8。Johnnson 等將此策略應(yīng)用于大鼠卵巢細(xì)胞 (本身無(wú) AGT

23、 酶中 hAGT 融合蛋白的熒光標(biāo)記。在 隨后的研究中,各種各樣的細(xì)胞蛋白(包括哺乳動(dòng) 物、酵母菌、細(xì)菌等 被標(biāo)記 30, 31。hAGT和芐基鳥(niǎo)嘌呤衍生物的反應(yīng)相對(duì)來(lái)說(shuō)是很 快的,最近分離到的高活性 hAGT 突變體和 BGFL 反 應(yīng)的二級(jí)速率常數(shù)為8000s -1mol/L -1。 這種標(biāo)記策 略的一個(gè)局限性是生物體內(nèi)大量存在的野生型的 AGT 會(huì)影響標(biāo)記的特異性。酵母菌和 E.coli 的 AGT不會(huì)和芐基鳥(niǎo)嘌呤衍生物反應(yīng), 但是哺乳動(dòng)物細(xì)胞 中的 AGT 能與芐基鳥(niǎo)嘌呤衍生物反應(yīng)。Johnsson 等 32合成了一種野生型 AGT 酶的抑制劑并得到了一 系列 A G T 的突變體,這

24、種野生型 A G T 的抑制劑對(duì) A G T 突變體沒(méi)有作用。在目標(biāo)蛋白和 A G T 突變體 (182個(gè)氨基酸,對(duì)烷基化的 DNA 沒(méi)有作用融合蛋 白所在的細(xì)胞中,事先注入野生型 AGT 抑制劑,然 后再注入芐基鳥(niǎo)嘌呤衍生物,就可以實(shí)現(xiàn)蛋白的特 異性標(biāo)記,這樣一種改良方法拓展了 AGT 標(biāo)記策略 的應(yīng)用范圍。目前已經(jīng)有多種野生型 AGT 抑制劑和 A G T 突變體可以很方便地購(gòu)買(mǎi)到?；?AGT 的標(biāo)記策略可以實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)記的蛋白進(jìn) 行體內(nèi)長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)小時(shí)的實(shí)時(shí)跟蹤,最后隨著融合蛋 白的降解,探針失效。由于融合 A G T 蛋白本身體 積較大,可能會(huì)影響目標(biāo)蛋白的活性。2.1.2.2脫鹵酶和受體組

25、合熒光探針普洛麥格公 司(Promega的研究者利用脫鹵素酶的特性提出了一 種與 AGT 融合蛋白類(lèi)似的新的蛋白標(biāo)記策略。野生 型的脫鹵素酶能夠使脂肪族鹵代物脫鹵變成醇,這 個(gè)過(guò)程可能通過(guò)兩步完成:脫鹵酶先發(fā)生親核取代 反應(yīng),脂肪族底物與天門(mén)氨酸鹽形成酯,接著酯水 解斷裂生成最終產(chǎn)物醇。對(duì)脫鹵酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行一些改 變就能使它催化的脫鹵反應(yīng)停留在酯的階段。將這 樣變異的脫鹵酶和目標(biāo)蛋白融合與各種連有不同報(bào) 告基團(tuán)的氯代物進(jìn)行反應(yīng),就能實(shí)現(xiàn)蛋白的特異標(biāo) 記(圖 10。這種方法專(zhuān)一性好,無(wú)論在真核生物細(xì) 胞或是 E.coli 細(xì)胞都能得到應(yīng)用, 但是脫鹵酶本身 由 293個(gè)氨基酸組成,體積是目前所報(bào)道的

26、蛋白標(biāo) 簽中最大的。2.1.2.3PPtase和受體(PCP、 ACP組合熒光探針 生物體內(nèi)的磷酸泛酰巰基乙酰轉(zhuǎn)移酶(PPtase可以將 磷酸泛酰巰基乙胺基團(tuán)從輔酶 A(CoA上轉(zhuǎn)移至?；?載體蛋白 ACP 的一個(gè)絲氨酸側(cè)鏈上,形成專(zhuān)一性的 共價(jià)結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在輔酶 A 的巰基上進(jìn) 行化學(xué)修飾后(連上生物素、熒光素等其他小分子 它仍然能夠?qū)崿F(xiàn)PPtase催化下的基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng) 33,34, 這就為它用于蛋白質(zhì)的特異性標(biāo)記打下了基礎(chǔ)(圖 11。由于 ACP 蛋白序列中沒(méi)有半胱氨酸殘基,這 種策略可以被應(yīng)用于氧化環(huán)境細(xì)胞表面 GPCR 蛋白圖7天然化學(xué)鏈接反應(yīng)用于蛋白熒光標(biāo)記圖8Diels-

27、Alder反應(yīng)用于蛋白熒光標(biāo)記 圖 9hAGT融合蛋白標(biāo)記策略8生命科學(xué) 第 20卷的各種標(biāo)記。 George等 35將這種思路首先用于酵母 菌細(xì)胞表面 a-凝集素受體蛋白 Avga2p 的熒光標(biāo)記。 他們先將 Avga2p 蛋白與?；d體蛋白 ACP 融合,融 合蛋白在6×His-PPtase以及熒光團(tuán)修飾的輔酶CoA-Cy3的作用下實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)專(zhuān)一性熒光標(biāo)記。運(yùn)用類(lèi)似 方法,George 等 35實(shí)現(xiàn)了人類(lèi)細(xì)胞表面 G 蛋白結(jié)合 受體 N K 1的熒光標(biāo)記。與ACP/PPtase組合類(lèi)似, Walsh等發(fā)展了多肽載 體蛋白 PCP 與 PPtase 組合用于蛋白的生物素標(biāo)記 36。

28、此后,Walsh 等又將此標(biāo)記策略結(jié)合 FRET 技術(shù)應(yīng) 用于細(xì)胞從環(huán)境攝取鐵的內(nèi)吞機(jī)制研究 37。他們將 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 TfR1與 PCP 融合,然后應(yīng)用 PPtase/ CoA-AlexaFluor488組合對(duì) TfR1進(jìn)行特異熒光標(biāo) 記,轉(zhuǎn)鐵蛋白用 AlexaFluor568標(biāo)記,通過(guò)檢測(cè) 兩個(gè)熒光團(tuán)之間的 FRET 效應(yīng),來(lái)對(duì)細(xì)胞攝取鐵的 過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤。Burkart等運(yùn)用CP/PPtase/CoA-stilbene組合對(duì)VibB 蛋白進(jìn)行標(biāo)記, 從而對(duì)它進(jìn)行熒光和親和作用雙重分 析 38。Walsh 等將 PCP 融合到抗菌素表面,利用各 種 CoA 底物,在抗菌素上連上了不同的

29、報(bào)告分子 39。 基于 PCP 或 ACP 和 PPtase 組合的蛋白標(biāo)記策略 主要具有以下優(yōu)點(diǎn) :(1PPtase協(xié)助的共價(jià)連接標(biāo)記 策略具有高效專(zhuān)一性, 1020min即可完成標(biāo)記(無(wú) 論在活細(xì)胞內(nèi)或是體外,這樣有利于實(shí)時(shí)觀測(cè)細(xì) 胞事件; (2ACP 或是 PCP 標(biāo)簽體積小(由 80個(gè)左右 的氨基酸組成,對(duì)目標(biāo)蛋白本身的生物活性影響 很小; (3PPtase 能夠?qū)Χ鄻拥男揎?CoA底物實(shí)現(xiàn)高 效的基團(tuán)轉(zhuǎn)移作用,使蛋白標(biāo)記多樣化。2.1.2.4生物素連接酶和受體組合熒光探針生物 素連接酶能夠?qū)B有它的受體的融合蛋白進(jìn)行生物 素化,蛋白的特異性生物素化本身也具有重要的生 物學(xué)價(jià)值,同時(shí)運(yùn)

30、用現(xiàn)在已有的各種連有抗生物素 的熒光探針就可以對(duì)生物素化的蛋白進(jìn)行熒光可視 檢測(cè)。 Ting等利用 E.coli 生物素連接酶實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞 表面蛋白的定點(diǎn)熒光標(biāo)記 40。 E.coli 細(xì)菌的生物素 連接酶BirA能夠高效地將生物素連接到一種由15個(gè) 氨基酸組成的多肽序列CP(acceptorpeptide的賴(lài)氨酸 殘基上。利用這一特性,巧妙將一個(gè)生物素的類(lèi)似 物(其中的兩個(gè)氮原子換成了兩個(gè)亞甲基在BirA和 ATP 協(xié)助下,與 HeLa 細(xì)胞的跨膜蛋白血小板生長(zhǎng) 因子受體上(事先通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法連上CFP-CP 的 CP 相連接,緊接著用含有酰肼的生物素探針 BP 對(duì)生物素類(lèi)似物上的游離羰基

31、進(jìn)行成腙連接, 完成了 跨膜蛋白的標(biāo)記(圖12。 為了研究這個(gè)標(biāo)記策略的效 率, 通過(guò)鏈親和酶素亞歷山大568(strepavidin-Alexa568來(lái)對(duì) BP探針熒光顯色。 結(jié)果表明轉(zhuǎn)染成 功的細(xì)胞(通過(guò)檢測(cè) CFP 的熒光的跨膜蛋白被成功 標(biāo)記(檢測(cè) Alexa568,而且標(biāo)記速度非?？?整 個(gè)過(guò)程約為 20min。EGFR蛋白(epidermalgrowthfactorreceptor在 細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸行為以及配體參與的二聚或是多聚具 有重要的生物學(xué)意義。Ting 等在 EGFR 蛋白的 N 端 連上了 CP 標(biāo)簽,然后在 BirA 和生物素類(lèi)似物下完 成了 CP 標(biāo)簽的生物素化,最后加

32、入 BP 探針實(shí)現(xiàn)了 EGFR 蛋白的標(biāo)記。他們通過(guò)免疫熒光檢測(cè)的方法 (檢測(cè)標(biāo)記 EGFR 蛋白在細(xì)胞中的分布以及 EGF 分 析手段,證明了 C P 肽段的引入對(duì) E G F R 蛋白的活 性幾乎沒(méi)有影響,這為以后用各種其他探針研究 圖11ACP/PPtase組合用于蛋白標(biāo)記 圖12生物素連接酶BirA用于蛋白標(biāo)記 圖10脫鹵酶融合蛋白標(biāo)記策略9第 1期 陳磊,等:特異性的蛋白小分子熒光探針及其標(biāo)記技術(shù)EGFR 蛋白的生物功能創(chuàng)造了條件。這種基于生物素連接酶的蛋白標(biāo)記策略的最大優(yōu)點(diǎn)在于它與目標(biāo)蛋白融合的標(biāo)簽比較小(15個(gè)氨基酸,對(duì)目標(biāo)蛋白影響較小,而且用到的各種酰肼的衍生物也可以很方便的制

33、備,但是第二步的成腙反應(yīng)比較慢,在 pH為7的條件下, 它的二級(jí)速率常數(shù)小于1s -1mol/L -1,較 A G T 或是 A C P 標(biāo)記反應(yīng)小了三個(gè)數(shù)量級(jí)。為了使標(biāo)記反應(yīng)能夠在幾分鐘內(nèi)完成,酰肼探針的濃度往往要達(dá)到毫摩爾級(jí),而且由于腙的形成反應(yīng)是可逆的,限制了它在一些酸性環(huán)境如內(nèi)涵體中的應(yīng)用。2.1.2.5轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase和受體組合熒光探針轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase能夠催化蛋白質(zhì)肽鏈中受體谷氨酸殘基中的 -酰胺基團(tuán)轉(zhuǎn)移到一個(gè)外加供體伯胺的氨基上。TGase 對(duì)發(fā)生反應(yīng)的谷氨酸周?chē)牡鞍仔蛄幸约翱臻g結(jié)構(gòu)因素要求比較高, 一些能夠暴露在溶劑中的谷氨酸才能作為酶底物, 而對(duì)供體伯胺的結(jié)構(gòu)

34、則沒(méi)有太多要求。 Sato 41和Taki等 42發(fā)現(xiàn)在一個(gè)蛋白的 C 端或是 N 端連上這樣一段具有特定序列的肽段(Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Met,在TGase 催化下Gln4是優(yōu)先作為反應(yīng)的受體與外來(lái)的胺反應(yīng)。Weiss 等 43用已有的方法在胰凝乳蛋白酶抑制劑 CI2(有 64個(gè)氨基酸組成中引入 Cys40,并在它的 N 端引入一段多肽標(biāo)簽(Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Met,新引入的 Cys40由于裸露在蛋白表面,所以它的巰基反應(yīng)性最高。通過(guò)加入 A l e x a488的馬來(lái)酰亞胺實(shí)現(xiàn)了 CI2的化學(xué)熒光標(biāo)記。然后在 TGase 的催化下和

35、熒光探針 Alexa647-(CH 2 6 -NH2反應(yīng),在多肽標(biāo)簽的 Gln4處特異性地實(shí)現(xiàn)了連 接反應(yīng)。雖然 CI2本身含有三個(gè) Gln 殘基,但由于 蛋白本身四級(jí)結(jié)構(gòu)立體因素的影響, 它們沒(méi)有參與 酶反應(yīng)。在得到了特異性的雙熒光標(biāo)記 C I 2后, Weiss等 43利用單分子FRET技術(shù)研究了它的折疊性 質(zhì) 。實(shí)驗(yàn)證明短肽標(biāo)簽(Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-M e t 的引入基本上不會(huì)影響蛋白本身的活性,在 T G a s e 的催化下,酶反應(yīng)高選擇性的在標(biāo)簽上的 Gln4發(fā)生。對(duì)于本身 Gln 含量高的蛋白一般也有很 高的選擇性,在特殊情況下可以對(duì)蛋白本身的某些 G

36、ln 用等排體 Asn 或是 Glu 代替。這樣一種兩步的 GTase 參與的高專(zhuān)一性的蛋白雙熒光標(biāo)記策略為蛋 白單分子 FRET 研究創(chuàng)造了有利的條件。2.1.2.6蛋白-蛋白相互作用用于蛋白熒光標(biāo)記 J äger等 44巧妙地利用了蛋白-蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)了 CI2蛋白的雙染料標(biāo)記并通過(guò) FRET 技術(shù)研究該蛋白 的結(jié)構(gòu)。由于 CI2蛋白本身沒(méi)有半胱氨酸,通過(guò)基 因的方法他們?cè)?N 端 Met1和 Lys2之間插入了一個(gè) 半胱氨酸,又將處于內(nèi)環(huán)中心的 Met40(對(duì)蛋白活性 不起作用換成了 Cys40。CI2和枯草桿菌蛋白酶 (BPN存在強(qiáng)烈的親和作用,而 Cys40恰好處于親 和

37、作用的區(qū)域,在作用體中它的巰基反應(yīng)活性被屏 蔽。在 CI2和 BPN 的作用體中,加入 Alexa647, 它定點(diǎn)地與 N 端的 Cys 相連,然后將 CI2/BPN 作用 體破壞,裸露的 Cys40再用 Alexa488進(jìn)行標(biāo)記 45。 通過(guò)簡(jiǎn)潔的三步操作, J äger等 44完成了對(duì)CI2蛋白 的雙染料標(biāo)記(圖 13。2.2非共價(jià)連接的蛋白熒光標(biāo)記2.2.1六組氨酸標(biāo)簽-鎳-熒光團(tuán)絡(luò)合物體系Ebright等 46首先報(bào)道了一種定點(diǎn)標(biāo)記方法, 這 種方法所用的短肽標(biāo)簽為 6個(gè)組氨酸,Cy3或 Cy5熒光團(tuán)通過(guò)兩個(gè)連接臂,并經(jīng)由兩個(gè)鎳離子與六組 氨酸標(biāo)簽通過(guò)強(qiáng)配位鍵絡(luò)合,從而實(shí)現(xiàn)蛋

38、白的定點(diǎn) 標(biāo)記(圖 14,并證明了它在 FRET 研究中應(yīng)用的可 行性。與雙砷染料 -四半胱氨酸標(biāo)簽體系相比,這 種體系可以應(yīng)用于氧化性的細(xì)胞環(huán)境中,六組氨酸 標(biāo)簽可通過(guò)生物學(xué)方法連接到目標(biāo)蛋白的 C-末端, 或者 N -末端,也可以插入蛋白質(zhì)肽鏈的中間。Guignet等 47將探針上的發(fā)色團(tuán)部分改為熒光 素,合成了兩個(gè)類(lèi)似的小分子熒光探針 NTA-I 和 圖13利用蛋白-蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)蛋白的熒光標(biāo)記 A=Alexa647,D=Alexa488圖14鎳-熒光團(tuán)絡(luò)合物對(duì)含有六組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì) 的定點(diǎn)標(biāo)記10生命科學(xué) 第 20卷NTA-II(圖15,它們能夠可逆地定點(diǎn)標(biāo)記蛋白(可以 通過(guò)加入 E

39、DTA 實(shí)現(xiàn)蛋白的去熒光標(biāo)記。Guignet 等 47在速激肽受體蛋白(一類(lèi) G 蛋白結(jié)合受體的位 于細(xì)胞外的 N 端和細(xì)胞內(nèi)的 C 端分別連上 GFP 和六 組氨酸標(biāo)簽,然后加入 NTA-I 型探針,檢測(cè)到 GFP 的熒光大大減弱,通過(guò)研究?jī)蓚€(gè)熒光團(tuán)之間的 FRET 效率,計(jì)算出兩個(gè)熒光團(tuán)之間的空間距離為 5.7nm 48。類(lèi)似的研究思路,他們用這種探針對(duì)活 細(xì)胞連有六組氨酸標(biāo)簽的 5-羥色胺受體 5HT3R 跨膜 蛋白 49進(jìn)行標(biāo)記后,通過(guò) FRET 技術(shù)來(lái)研究該跨膜 蛋白的結(jié)構(gòu)。Piehler等設(shè)計(jì)了3-NTA-F型熒光探針, 它們具 有三個(gè) Ni 離子中心,對(duì) 6-His 標(biāo)簽識(shí)別的特

40、異性較 傳統(tǒng)的雙 Ni 離子中心探針又有增強(qiáng)(圖 16 50。由 于存在三個(gè)配位點(diǎn),它與蛋白的結(jié)合能力增強(qiáng)。他 們將其用于四蛋白相互作用體系的研究?；?6-His/NTA 的標(biāo)記策略可以在活細(xì)胞中實(shí) 現(xiàn)對(duì)蛋白的快速、可逆、專(zhuān)一的熒光標(biāo)記,而不 會(huì)傷害母體細(xì)胞,而且這類(lèi)探針制備簡(jiǎn)單,但這類(lèi) 標(biāo)記是通過(guò)非共價(jià)相互作用實(shí)現(xiàn)的,所以探針壽命 比較短(幾分鐘,一般僅適用于膜外蛋白的標(biāo)記。 最近,Tsien 等 51又設(shè)計(jì)了基于六組氨酸標(biāo)簽 的熒光探針(圖 17。和前面所提到的 6-His/NTA 探 針的主要差別在于它選用了對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的,反應(yīng) 惰性的 Zn 2+。由于 Zn 2+不具有熒光淬滅作用,

41、所以 整個(gè)熒光探針可以設(shè)計(jì)得比較緊湊。與傳統(tǒng)的 6-His/NTA 探針比,新型的 Zn 2+中心探針與六組氨酸 標(biāo)簽之間的作用較強(qiáng),可能是由于兩個(gè)配位的 Zn 2+之間的距離縮短了。運(yùn)用這種新型的熒光探針, Tsien等 51揭示了STIM1蛋白(控制鈣離子通道激活 包含鈣離子受體域的 N 端是暴露在質(zhì)膜外的。而以 前的各種熒光探針如熒光蛋白、H A 標(biāo)簽以及辣根 過(guò)氧物酶都沒(méi)有得出此結(jié)論。2.2.2F36V型熒光探針Clackson 等利用 FKBP12蛋白(含有 108個(gè)氨基 酸與一種合成的配體因子(SLF的高親和力相互作用 研究了蛋白的二聚化。Marks 等 52提出了一種利用 FKB

42、P12的變體(F36V與相應(yīng)的聯(lián)有熒光團(tuán)的配體 (FL-SLF 存在高親和力的特性來(lái)熒光標(biāo)記牛乳糖 酶,在 3T3纖維原細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了光誘導(dǎo)產(chǎn)生單線態(tài) 氧的定點(diǎn)蛋白失活(圖 18 。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中, FL-SLF' 與 F36V 融合的蛋白質(zhì)連接,可以用來(lái)檢測(cè) 蛋白的亞細(xì)胞定位,并且在 F36V 融合的蛋白質(zhì)表 達(dá)水平很低的情況下也能容易地檢測(cè)出兩者之間地 結(jié)合。另外,熒光的強(qiáng)度與 F36V 融合蛋白的表達(dá) 水平成比例。2.2.3抗體、 抗生物素型熒光探針Farinas和Verkman 53報(bào)道了基于半抗原-抗體 的結(jié)合作用設(shè)計(jì)的分子探針。他們選擇單鏈的抗體 sFv 作為受體,連有熒光

43、素的抗原 phOx 作為配體, 測(cè)量了高爾基體內(nèi)腔的 pH 值(熒光素的光譜性質(zhì)受 pH 值影響。與他們的研究相似,Wu 等 54將融合 到目標(biāo)蛋白的抗生物素蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表 達(dá),這些細(xì)胞隨后與有著膜透性的連有生物素的熒 光探針一起培養(yǎng),利用生物素-抗生物素蛋白的作 用實(shí)現(xiàn)了蛋白的熒光標(biāo)記,并測(cè)量了細(xì)胞內(nèi)分泌路 徑的 pH 值。然而,通過(guò)抗體或抗生物素蛋白對(duì)普 通的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記時(shí),效果不是很理想。 圖15小分子蛋白熒光探針NTA-I和NTA-II 圖163-NTA-F型熒光探針11 第 1期 陳磊,等:特異性的蛋白小分子熒光探針及其標(biāo)記技術(shù) 在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)抗生物素蛋白或鏈霉抗生

44、物素蛋 白對(duì)胞質(zhì)溶膠有毒性,而且生物素衍生的探針需要 和天然輔因子競(jìng)爭(zhēng)才能結(jié)合到標(biāo)簽上,這兩點(diǎn)大大 限制了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。 Farinas和Verkman 53也 指出,自己所研究的抗體在還原環(huán)境的細(xì)胞中不能 很好地表達(dá);另一方面抗生物素蛋白是相對(duì)分子質(zhì) 量為 63000的四聚體, 它過(guò)大的體積會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白 質(zhì)的功能有所影響。 2.2.4DHFR型熒光探針Cornish等 54提出一種以二氫葉酸還原酶(DHFR 作為受體的蛋白質(zhì)活體標(biāo)記方法。DHFR 是一種含 有 157個(gè)氨基酸的單體酶,DHFR 抑制劑甲氨蝶呤 (M t x 與 D H F R 的結(jié)合具有很高的親和力。另外, Mtx 能夠

45、抑制 DHFR 的蛋白水解,并且 Mtx 在 -羧基處被化學(xué)修飾后并不改變其與 D H F R 結(jié)合的性 質(zhì)。 因此在 -羧基連有熒光團(tuán)的甲氨蝶呤常被用于 熒光標(biāo)記 DHFR,檢測(cè)細(xì)胞中 DHFR 的濃度水平(圖 19。Remy 和 Michnick 55在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,將 DHFR 與目標(biāo)蛋白融合后,用連有熒光素的 Mtx 對(duì) 蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記, 用于監(jiān)測(cè)它的亞細(xì)胞定位。 Miller 等 56進(jìn)一步在大鼠卵巢細(xì)胞中用Mtx-TexasRed TM 選 擇性標(biāo)記與 E.coli. eDHFR融合的蛋白質(zhì)(位于質(zhì)膜 或是細(xì)胞核,反應(yīng)顯示出很低的背景熒光值和快 速的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。這種標(biāo)記策略要面臨

46、這樣一個(gè)主要問(wèn)題:在洗 掉過(guò)量的熒光探針的同時(shí),融合蛋白也會(huì)根據(jù)它與 熒光探針結(jié)合的牢固程度慢慢地失去它的熒光標(biāo)記 標(biāo)記物,因此這類(lèi)標(biāo)簽的應(yīng)用也受到了明顯的限 制 。2.2.5內(nèi)蛋白介導(dǎo)的蛋白標(biāo)記策略Giriat和Muir 57運(yùn)用內(nèi)蛋白介導(dǎo)的方法在活細(xì) 胞中成功實(shí)現(xiàn)了蛋白熒光標(biāo)記。運(yùn)用蛋白重組方法 先在目標(biāo)蛋白 C 端上融入 SspDnaE 內(nèi)切蛋白的一 半,然后將連有另一半內(nèi)切蛋白的熒光探針以及蛋 白轉(zhuǎn)導(dǎo)域肽(PTD加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中,內(nèi)切蛋白 被分割的兩半自連接后進(jìn)行剪接,實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)蛋白 的熒光標(biāo)記(圖 20。這樣的標(biāo)記過(guò)程往往需要幾個(gè) 小時(shí)。 3總結(jié)后基因組時(shí)代的到來(lái)給生物學(xué)家和化學(xué)家

47、們帶 圖18FKBP12(F36V和其配體組合用于蛋白熒光標(biāo)記 圖 19DHFR/Mtx組合用于蛋白熒光標(biāo)記圖20內(nèi)蛋白介導(dǎo)的蛋白標(biāo)記策略圖17鋅-熒光團(tuán)絡(luò)合物對(duì)含有六組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)的定點(diǎn)標(biāo)記12生命科學(xué) 第 20卷來(lái)了新的挑戰(zhàn),對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究成了眾多研究 領(lǐng)域的重要組成部分。近年來(lái)在蛋白質(zhì)的特異熒光 標(biāo)記方面,尤其是分子小、量子效率高的熒光探針 分子設(shè)計(jì)與應(yīng)用方面的研究取得了較大進(jìn)展,出現(xiàn) 了各種適用于不同體系的新穎的特異性標(biāo)記策略。 ACP-PPTase 組合體系、生物素連接酶 /受體組 合體系以及鎳離子-六組氨酸標(biāo)簽體系僅僅適用于細(xì) 胞表面蛋白的標(biāo)記,而細(xì)胞內(nèi)蛋白的標(biāo)記則需要借 助

48、其他的標(biāo)記策略。在還原性環(huán)境中如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雙砷染料 -四半胱氨 酸體系則可以發(fā)揮其優(yōu)勢(shì),同時(shí) F 36V 、D H F R 、 hAGT 型熒光探針也可以適用于還原性體系。而鎳 離子-六組氨酸標(biāo)簽體系和單鏈抗體型熒光探針則可 以在氧化環(huán)境中實(shí)現(xiàn)蛋白的特異性標(biāo)記?；谌诤系鞍椎臉?biāo)記策略往往會(huì)因?yàn)槿诤系鞍?本身表達(dá)水平低而影響其檢測(cè)的靈敏度,F36V 型 探針,改良的 hAGT 體系和 DHFR 型探針可以在融 合蛋白表達(dá)水平很低的體系中應(yīng)用,并具有較高的 信噪比。雙砷染料 -四半胱氨酸體系和生物素連接 酶體系對(duì)目標(biāo)蛋白本身的生物功能影響較小。 實(shí)現(xiàn)不同的生物學(xué)目的,各種熒光探針也具有 不同的應(yīng)用場(chǎng)合

49、。到目前為止只有雙砷染料 -四半 胱氨酸體系、ACP-PPTase 體系以及 hAGT 型探針 被應(yīng)用于蛋白的多色標(biāo)記定位以及脈沖追蹤試驗(yàn) 中。在熒光團(tuán)協(xié)助光失活研究中,F36V 型探針以 及雙砷染料-四半胱氨酸體系是最理想的。長(zhǎng)時(shí)間 標(biāo)記示蹤試驗(yàn)(24h 或更長(zhǎng)中,共價(jià)連接的標(biāo)記策 略是比較理想的。hAGT 型探針雖然是一種共價(jià)連 接的策略,但 hAGT 融合蛋白的降解限制了它在長(zhǎng) 時(shí)間示蹤試驗(yàn)中的應(yīng)用,而雙砷染料 -四半胱氨酸 體系是細(xì)胞內(nèi)蛋白長(zhǎng)時(shí)間示蹤的理想標(biāo)記策略。生 物素連接酶和ACP-PPTase體系則可以運(yùn)用于細(xì)胞表 面蛋白的長(zhǎng)時(shí)間示蹤。雙砷染料 -四半胱氨酸體系 也是電鏡分析的

50、良好標(biāo)記策略。到目前為止,在 FRET 技術(shù)在生物體系的應(yīng)用中,最為成熟的是雙 砷染料 -四半胱氨酸體系,已有研究表明,CFP 和 雙砷熒光素之間 FRET 效率是 CFP 和 YFP 之間效率 的5倍。在各種生物環(huán)境復(fù)雜的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的 特異性標(biāo)記仍具有挑戰(zhàn)性,尚未在真正意義上實(shí)現(xiàn) 運(yùn)用多種參數(shù)對(duì)生物活體內(nèi)各類(lèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀 測(cè),動(dòng)態(tài)研究。在以后的研究工作中,我們要開(kāi) 發(fā)出更多能用于活體內(nèi)不同種類(lèi)蛋白分析的特異性 小分子熒光探針,靈活采用不同的熒光探針與目標(biāo) 作用方式,并結(jié)合激光共聚焦等熒光成像技術(shù)對(duì)蛋 白分子進(jìn)行活體實(shí)時(shí)檢測(cè)追蹤。參考文獻(xiàn)1ShimomuraO,JohnsonFH,

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