分子克隆操作技術(shù)注意事項(xiàng)(20210111042921)

1、分子克隆操作技術(shù)注意事項(xiàng)引物設(shè)計(jì)1. 設(shè)計(jì)模板：基因過表達(dá)的設(shè)計(jì)模板為mRNA （根據(jù)基因名稱和樣品種屬從NCBI 查詢） , 啟動子（轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域）的設(shè)計(jì)模板為基因組 DNA 片段（根據(jù)基因名稱和種屬從 UCSC 查詢，并在 NCBI 核實(shí)序列）， DNA 甲基化分析（CpG島，根據(jù)基因名稱和種屬從 UCSC查詢，并在NCBI核實(shí)序列）;2. 設(shè)計(jì)軟件： Vector NTI 用于設(shè)計(jì)過表達(dá)引物， Vector NTI 用于設(shè)計(jì)啟動子 （轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域）克隆引物; Methprimer 用于設(shè)計(jì) DNA 甲基化分析引物（ BSP,MSP)3. 5'和 3'端的酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿

2、基所用的載體的多克隆位點(diǎn)（MCS）有，所克隆的序列沒有，可以同時做雙酶切, 我們的酶庫有，價(jià)格便宜的，加了保護(hù)性堿基可以直接進(jìn)行 PCR產(chǎn)物酶切的（詳 情見保護(hù)性堿基 .doc）;引物溶解1.引物的儲液濃度為100卩M,計(jì)算加入滅菌水的量;2.3.4.引物溶液應(yīng)-20 C保存;打開管蓋前，必須先12000RPM離心2min,因?yàn)橐餅榉勰?，容易飄出；加入滅菌水溶解前，應(yīng)稍微打開管蓋即可，以免粉末飄出;5.引物使用的工作液濃度為10卩M,需要多少稀釋多少，剩余的應(yīng)丟棄;PCR1. 操作注意事項(xiàng)：操作前，應(yīng)熟知所用 PCR 酶的說明書，并熟知說明書標(biāo)示的 注意事項(xiàng)（引物、模板和酶的建議用量，變性溫

3、度及時間，延伸速度等）PCR是極為靈敏的技術(shù)，因此要決定避免交叉污染，注意冰上操作，這樣可 以提高擴(kuò)增的特異性;2. 理解掌握每步操作的原理和注意事項(xiàng);3. PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，應(yīng)考慮以下幾個問題：引物的使用量，引物的反應(yīng)濃度一般為0.2-1卩M ;模板的用量，各種模板的建議用量參考PCR酶說明書，原則上第一次進(jìn)行 PCR 反應(yīng)時，采取中間值;4. PCR常見問題及對策問題原因?qū)Σ邲]有任何條帶（“白板”）PCR體系中成分是否有 遺漏添加重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)沒有目的條帶，但有引物二聚體反應(yīng)效率過低，其中原因 可能是引物與模板的配 比不合適，不是模板加得 越多反應(yīng)效率就越高，退 火溫度過高，導(dǎo)致引物與 模板

4、無法配對調(diào)整引物與模板的配比， 一般按照PCR酶的說明 書的建議選擇合適的引 物和模板的添加量，降低 退火溫度有目的條帶，但產(chǎn)量低反應(yīng)效率低，其中原因可 能是引物與模板的配比 不合適，不是模板加得越 多反應(yīng)效率就越高，退火 溫度高，導(dǎo)致引物與模板 結(jié)合配對不穩(wěn)調(diào)整引物與模板的配比， 一般按照PCR酶的說明 書的建議選擇合適的引 物和模板的添加量，降低 退火溫度有目的條帶，但有其他雜 帶反應(yīng)特異性不咼，其中原 因可能是引物設(shè)計(jì)存在 缺陷，退火溫度較低提咼退人溫度，如果目的 帶與雜帶相距較遠(yuǎn)，產(chǎn)物 產(chǎn)量可以滿足下游實(shí)驗(yàn) 需要，可不考慮重新設(shè)計(jì) 引物四、長引物退火產(chǎn)生DNA雙鏈一般通過PCR擴(kuò)增所需

5、的DNA雙鏈，如果DNA雙鏈膠短（150bp以內(nèi)），這可 以通過合成互補(bǔ)長引物，并在引物兩側(cè)預(yù)留 酶切后的酶切位點(diǎn)，通過變性退火程序即可形成互補(bǔ)的DNA雙鏈，一般在制備shRNA編碼框，miRNA過表達(dá)或干擾編碼框時，可以采取上述策略;五、全基因合成如果通過PCR技術(shù)無法獲取目標(biāo)DNA片段，我們一般委托DNA合成公司進(jìn)行全基因合成， 只需告知我們需要合成的序列， 并在序列的兩側(cè)加上克隆所需的酶 切位點(diǎn)，服務(wù)公司合成后將克隆至克隆載體中， 我們收到重組克隆載體 （我們自 己需要進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定） ，需要利用預(yù)留的酶切位點(diǎn)亞克隆至我們的目標(biāo)載體中，然后進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定；、.六、瓊脂凝膠

6、電泳1.2.作用：PCR產(chǎn)物鑒定，酶切產(chǎn)物鑒定，膠回收純化 PCR或酶切產(chǎn)物;3.膠濃度：一般為 1%，根據(jù)分析產(chǎn)物的大小選擇合適的膠濃度；電壓：電壓高，泳動速度快，耗時短，但產(chǎn)熱量大，容易燒膠，條帶模糊，電壓低，泳動速度慢，耗時長，但產(chǎn)熱量小，條帶清晰，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的電壓；4.電泳緩沖液： 加入電泳緩沖液的量高過膠面 1厘米以上，如果進(jìn)行膠回收時， 必須使用新的電泳緩沖液液，這是為了避免污染（電泳槽和膠槽也需清洗干 凈并用超純水潤洗）和提高回收效率（舊電泳緩沖液的PH環(huán)境不利用DNA回收）；5.理解掌握每步操作的原理和注意事項(xiàng)；七、 酶切1.DNA 的用量： 一般使用 0.5-1u

7、g, 這樣可以保證條帶清晰，切產(chǎn)物中有目的條帶小于250b P使用考慮使用較多DNA酶切充分； 如果酶 進(jìn)行酶切，否則目的條帶不清晰；2.限制性內(nèi)切酶的用量：根據(jù)酶的活性單位進(jìn)行添加，一般1ul 酶含 10 個活性國際單位，可以在 1 小時內(nèi)充分酶切 1ugDNA ，一般酶的用量不能超過酶切體系的 1/10 體積，否則產(chǎn)生星活性（酶切不特異）3.酶切體系：酶切總體系一般為 20-30ul ，體系大，可以使抑制酶切的因素稀釋， 但做瓊脂糖凝膠電泳時需要配制較厚的膠，根據(jù) DNA 的濃度和純度選擇合適的酶切體系；4.緩沖液：根據(jù)限制性內(nèi)切酶廠家的要求選擇合適的緩沖液（buffer），進(jìn)行雙酶切時，

8、查詢廠家提供的雙酶切反應(yīng)緩沖液表格即可;5.理解掌握每步操作的原理和注意事項(xiàng)；八、DNA 片段純化1.PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物，酶修飾產(chǎn)物，如需進(jìn)行下一步酶學(xué)操作，必須先進(jìn)行 純化回收；2.方法：膠回收純化試劑盒或 PCR 產(chǎn)物回收純化試劑盒， 膠回收純化試劑盒是 通用試劑盒，適用于所有情況， PCR 產(chǎn)物回收純化試劑盒只適用于產(chǎn)物中片段特異的情況，例如 PCR 產(chǎn)物特異，酶切產(chǎn)物大小特異，修飾酶產(chǎn)物；3.4.進(jìn)行膠回收時注意紫外線照射時間勿超過 60S，否則導(dǎo)致DNA片段突變;理解掌握每步操作的原理和注意事項(xiàng)；九、去磷酸化1. 單酶切的載體或目的片段進(jìn)行連接時， 它們各自在體內(nèi)和體外容易進(jìn)行自連

9、， 為防止自連，必須利用磷酸化酶（CIP）進(jìn)行去磷酸化處理；2. 理解掌握每步操作的原理和注意事項(xiàng)；十、 磷酸化處理1. 某些情況下，如果該片段的末端沒有磷酸基團(tuán)，自連是無法發(fā)生的，如需要 對片段進(jìn)行自連，則需要利用激酶進(jìn)行磷酸化處理;2. 理解掌握每步操作的原理和注意事項(xiàng)；DNA 連接1. 載體片段與目的片段的用量： 目的片段與載體片段的摩爾比應(yīng)大于 3:1，小于10:1，載體片段與目的片段的總用量因大于 50ng 小于 200ng;2. 連接體系：總連接體系一般為10-20UI,體系小，載體片段與目的片段的碰撞幾率提高，從而提高連接效率，在各種條件滿足的條件下，盡量進(jìn)行小體系連接；3. 連

10、接時間和連接溫度： 參考連接酶的操作指南， 如果片段的兩端均為粘末端， 可進(jìn)行室溫短時間連接，如果片段的兩端有一端或兩端為平末端，應(yīng)進(jìn)行低溫長時間連接；4. 理解掌握每步操作的原理和注意事項(xiàng)；十二、 感受態(tài)細(xì)胞制備1. 感受態(tài)細(xì)胞種類：熱擊感受態(tài)細(xì)胞（ CaCl2 法），電擊感受態(tài)細(xì)胞（ 10%甘油 法）;2. 細(xì)菌轉(zhuǎn)接：復(fù)蘇的細(xì)菌切勿培養(yǎng)超過16h，否則細(xì)菌太老了，活力極差；轉(zhuǎn)接比例應(yīng)控制在 1:500-1:1000，這樣保證后續(xù)生長的細(xì)菌的活力，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)體積，根據(jù)實(shí)際需要決定，但培養(yǎng)體積不可超過培養(yǎng)器皿總體積的1/3；3. 細(xì)菌生長條件：嚴(yán)格按照目的細(xì)菌的生長溫度，保證振蕩速度不低于225

11、RPM,這樣可以保證換氧充分，生長旺盛;4. 細(xì)菌生長密度：如果進(jìn)行熱擊感受態(tài)細(xì)胞制備， 菌液的 OD600 值應(yīng)為 0.2-0.3， 肉眼觀察到現(xiàn)象為云霧狀， 如果進(jìn)行電擊感受態(tài)細(xì)胞制備， 菌液的 OD600 值應(yīng)為 0.5-0.6，肉眼觀察到現(xiàn)象為濃云霧狀；5. 離心操作：隨著離心操作次數(shù)的增加，細(xì)菌會變得越來越脆弱和松散，所以 在進(jìn)行吸液操作時應(yīng)極為小心， 在保證不吸走細(xì)菌的前提下， 盡量移除上清;6. 無菌操作：注意無菌操作，注意別離酒精燈火焰太近，否則導(dǎo)致細(xì)菌燙死;7. 理解掌握每步操作的原理和注意事項(xiàng);十三、轉(zhuǎn)化1. 轉(zhuǎn)化方法：熱擊轉(zhuǎn)化和電擊轉(zhuǎn)化;2. 注意事項(xiàng)：無菌操作，冰上操作

12、，快速操作;3. 感受態(tài)細(xì)菌與 DNA （連接產(chǎn)物或質(zhì)粒）復(fù)合時，應(yīng)把 DNA 加入感受態(tài)細(xì)菌 中，并在冰上放置一段時間，以保證 DNA 與感受態(tài)細(xì)菌的表面從分接觸;4. 理解掌握每步操作的原理和注意事項(xiàng);十四、 平板克隆篩選1. 抗生素平板制備：加入抗生素時，注意培養(yǎng)基的溫度，太高容易導(dǎo)致抗生素?zé)崾Щ睿腿菀讓?dǎo)致培養(yǎng)基提取凝固，從而不能進(jìn)行倒板操作;為控制合適的溫度， 應(yīng)不時搖晃瓶子， 這樣保證培養(yǎng)基的溫度與瓶子表面的溫度一致，用手感知瓶子表面的溫度，以不燙手為宜;2. 菌液涂布：加入合適的菌液并涂布均勻，菌液加多了，平板不易涂布均勻和干燥，加上轉(zhuǎn)化效率較高，則導(dǎo)致菌落太密，菌液加少了，平

13、板不易涂布均勻，加上轉(zhuǎn)化效率較低，則導(dǎo)致菌落太稀疏，因轉(zhuǎn)化效率不能提前得知，為保證成功率，可進(jìn)行梯度涂板;3. 培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度按照該細(xì)菌的生長溫度，倒扣培養(yǎng)，切勿正置培養(yǎng)，培養(yǎng)時間一般不超過12-16h,否則容易長出衛(wèi)星菌（細(xì)菌發(fā)生突變了），后期加強(qiáng)觀察，根據(jù)菌落大小隨時取出，并倒扣（并用封口膜封口）放置于4C4. 克隆平板從4C取出時或后面的觀察和使用操作均需保證平板倒扣放置，否則平板上的冷凝水與克隆接觸，從而導(dǎo)致菌落交叉污染；5. 理解掌握每步操作的原理和注意事項(xiàng)；十五、 細(xì)菌培養(yǎng) 1.接種：用牙簽挑取菌落（放置于 4C下超過2周的菌落不易使用）并在培養(yǎng)基中潤洗，或用槍頭吹打甘油菌（在

14、-80 C下放置），然后槍頭在培養(yǎng)基中潤洗；培養(yǎng)體積不可超過培養(yǎng)器皿總體積的 1/3； 2. 培養(yǎng)條件：嚴(yán)格按照目的細(xì)菌的生長溫度，保證振蕩速度不低于 225RPM，這樣可以保證換氧充分， 生長旺盛；培養(yǎng)時間不要超過 16小時， 否則細(xì)菌老 化，抗性丟失，質(zhì)粒產(chǎn)量嚴(yán)重降低；3. 理解掌握每步操作的原理和注意事項(xiàng)；十六、 質(zhì)粒提取1. 提取試劑盒：如果提取的質(zhì)粒只需進(jìn)行酶切鑒定，請使用 OMEGA 廠家或其 它國產(chǎn)生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的小量試劑盒即可，如果提取的質(zhì)粒需進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，請使用 QIAGEN 廠家生產(chǎn)的中量提取試劑盒， 這樣可以包裝足夠的產(chǎn)量和純度（超螺旋結(jié)構(gòu)，具有轉(zhuǎn)染活性） ；2. 用于質(zhì)粒

15、提取的細(xì)菌的培養(yǎng)時間不要超過 16 小時；3. 注意事項(xiàng)：不是用于提取質(zhì)粒的菌量越多，質(zhì)粒的產(chǎn)量就越多，因?yàn)橘|(zhì)粒提取試劑盒的每份試劑的能力是有限的，超過每份試劑的能力，反而導(dǎo)致產(chǎn)量減低；4. 理解掌握每步操作的原理和注意事項(xiàng)；十七、酶切鑒定1. DNA 的用量：一般使用 0.5-1ug, 這樣可以保證條帶清晰，酶切充分；如果酶切產(chǎn)物中有目的條帶小于250bP,使用考慮使用較多DNA進(jìn)行酶切，否則目的 條帶不清晰；2. 限制性內(nèi)切酶的用量： 根據(jù)酶的活性單位進(jìn)行添加， 一般 1ul 酶含 10 個活性 國際單位，可以在 1 小時內(nèi)充分酶切 1ugDNA ，一般酶的用量不能超過酶切體系的 1/10 體積，否則產(chǎn)生星活性（酶切不特異）3. 酶切體系：酶切總體系一般為 20-30ul,體系大，可以使抑制酶切的因素稀釋，但做瓊脂糖凝膠電泳時需要配制較厚的膠，根據(jù) DNA 的濃度和純度選擇合 適的酶切體系；4. 緩沖液：根據(jù)限制性內(nèi)切酶廠家的要求選擇合適的緩沖液（buffer），進(jìn)行雙酶切時，查詢廠家提供的雙酶切反應(yīng)緩沖液表格即可；5.