pepc酶活的測(cè)定

1、2. 實(shí)驗(yàn)試劑：50mM ATP溶液，50mM磷酸肌酸溶液，0.2mM NaHCO3溶液，160U/ml磷酸肌酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油醛脫氫酶溶液（U為酶活力單位），25mM RuBP溶液，5mM NADH，Rubisco提取介質(zhì)（40mM Tris-HCl緩沖液，pH7.6，內(nèi)含10mM MgCl2溶液，0.25mM EDTA，5mM谷胱甘肽），反應(yīng)介質(zhì)（0.1M Tris-HCl緩沖液，pH7.8，內(nèi)含12mM MgCl2溶液，0.4mM EDTA）。3實(shí)驗(yàn)步驟3.1 酶粗提液的準(zhǔn)備取新鮮洗干凈的條斑紫菜的絲狀體和條斑紫菜的葉狀體各1克，加入預(yù)冷

2、的提取介質(zhì)1ml，冰浴研磨10min，將樣品在40C，10,000×g離心10min，棄沉淀；上清夜即是酶粗提液，置于00C備用（王維光，1985；張志良等，2003）。3.3.2 Rubisco酶活力的測(cè)定按下表配制反應(yīng)體系：試劑 加入量ml5mM NADH 0.2 50mM ATP 0.2 酶提取液 0.1 50mM磷酸肌酸 0.2 0.2mM NaHCO3 0.2 反應(yīng)介質(zhì) 1.4 160U/ml磷酸肌酸激酶 0.1 160U/ml磷酸甘油酸激酶 0.1 160U/ml磷酸甘油醛脫氫酶 0.1 雙蒸水 0.3將配制好的反應(yīng)體系混勻，倒入比色杯內(nèi)，以蒸餾水為空白，在紫外分光光度計(jì)

3、計(jì)上測(cè)量340nm處反應(yīng)體系的OD值，作為零點(diǎn)值。將0.1mlRuBp加入比色杯內(nèi)，立即計(jì)時(shí)，每隔20s測(cè)一次OD值，共測(cè)3min。以零點(diǎn)到第1min的OD值下降的絕對(duì)值計(jì)算酶活力。由于酶提取液中可能存在3-磷酸甘油酸（PGA），會(huì)使酶活力的測(cè)定產(chǎn)生誤差，因此除上述測(cè)定外還需做一個(gè)不加RuBp的對(duì)照。對(duì)照的反應(yīng)體系與上述酶的反應(yīng)體系完全一樣，所不同的僅僅是把酶提取液放在最后加，加入后馬上測(cè)定此反應(yīng)體系340nm處的OD值，并記錄前1min內(nèi)OD值的變化量。計(jì)算酶活力變化時(shí)應(yīng)減去這一變化量。3.3.3 Rubisco活力的計(jì)算酶活力=（ODN10）/（6.22×2dt）式中：OD為反應(yīng)

4、最初1min內(nèi)340nm處OD值變化的絕對(duì)值（減去對(duì)照液最初1min的變化量）；6.22為每mmol NADH在340nm處的光密度；N為酶液稀釋倍數(shù)；2表示每固定1mol的CO2有2mol的NADH被氧化；d為比色杯光程（cm），t表測(cè)定時(shí)間為1min；酶活力單位為mmolCO2/ml(酶液).min。注意：RuBp不穩(wěn)定，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。mol/g fresh weight·h4 條斑紫菜絲狀體和條斑紫菜葉狀體磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性差異的研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶廣泛存在與高等植物、細(xì)菌以及藻類中，催化磷酸烯醇式丙酮酸和碳酸氫根形成草酸乙酸，該反應(yīng)不可逆，是C4植物

5、光合途徑中的關(guān)鍵酶，起著固定原初CO2的作用。在細(xì)菌中對(duì)三羧循環(huán)起著調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)用偶聯(lián)法測(cè)定酶的活性。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在PEP、H2CO3、Mg2+存在時(shí)，形成草酸乙酸，而草酸乙酸在NADH及蘋果酸脫氫酶存在下可生成蘋果酸及NAD，NAD形成的速度可在340nm處進(jìn)行測(cè)定，并以O(shè)D值下降0.01作為一個(gè)酶活性單位（王維光，1985；張志良等，2003）。4.1器材與試劑4.1.1實(shí)驗(yàn)儀器：Unico UV-2100 specterometer紫外分光光度計(jì)，冷凍高速離心機(jī)，秒表，移液槍 研缽。4.1.2實(shí)驗(yàn)試劑：提取緩沖液0.1M Tris-H2SO4緩沖液，pH8.2，含7mM巰基

6、乙醇（547mg/L），1mM EDTA（292 mg/L），5%的甘油，洗脫緩沖液10mM Tris-H2SO4緩沖液，含0.2mM EDTA（58 mg/L），0.2mM二硫蘇糖醇（31 mg/L），5%的甘油，pH8.2，反應(yīng)緩沖液50mM Tris-HCl緩沖液，pH9.2，反應(yīng)混合液0.5ml 70mM Mg SO4（17.3mg/L），0.5ml 70mM NaHCO3，1ml 14mM PEP（2.9 mg/L）混合，以上溶液都用反應(yīng)緩沖液配制。需用時(shí)再加入1.5ml內(nèi)含0.35mg NADH及過量的蘋果酸脫氫酶的反應(yīng)緩沖液。4.2實(shí)驗(yàn)步驟4.2.1 酶提取液的準(zhǔn)備取新鮮洗干凈的

7、條斑紫菜的絲狀體和條斑紫菜的葉狀體各1克，加入預(yù)冷的提取介質(zhì)1ml，冰浴研磨10min，將樣品在40C，10000×g離心10min，棄沉淀；上清夜即是酶粗提液，置于00C備用。4.2.2 PEPC酶活力的測(cè)定 于石英比色杯中加入反應(yīng)混合液3.5ml，并加入1ml粗酶液混勻后啟動(dòng)反應(yīng)，立即與分光光度計(jì)340nm處按3min，20s間隔讀取OD值，以O(shè)D值下降0.01作為一個(gè)酶活力單位。UV-B輻射對(duì)苜蓿幼葉內(nèi)Rubisco、H2O2含量及蛋白水解酶活性的影響3Makino A, Mae T, Ohira K.Colorimetric measurement of protein wi

8、th Coomassie brilliant blue R on sodium dodecyl sul-fate-polycarylamide gel electrophoresis by eluting with for-mamideJ.Agr Biol Chem,1986,50:1911-1912·2.PEPC于花后15 d和20 d每品種各處理分別取樣15株冬小麥帶回實(shí)驗(yàn)室,旗葉和穗器官分開,在液氮中迅速冷凍并置于-80冰柜用于測(cè)定旗葉、穎片和籽粒PEPC活性。酶的提取按Sayre27方法進(jìn)行。酶活性測(cè)定采用Blanke28的酶偶聯(lián)法。27Sayre R T, Kennedy

9、R A. Photosynthetic enzyme activities and localization in Mollugo verticillata populations differing in the leaves of C3and C4cycle operationJ.Plant Physiology,1979,64:293-299.28Blanke M M, Ebert G. Phosphoenolpyruvate carboxylase and carbon economy of apple seedlingsJ.Journal of Experimental Botany

10、,1992,43:965-968.JiangD-A (蔣德安), Lu Q(陸慶), Weng X-Y(翁曉燕),etal. Regulation of Rubisco carboxylation activ-ity and photosynthetic rate by Rubisco activase during leaf senescence in rice.Journal ofZhejiang University (Agriculture and Life Sciences) (浙江大學(xué)學(xué)報(bào)·農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2000,26(2): 119-124 ( in Chi-小

11、麥Rubisco的純化、鑒定及其活性測(cè)定Rubisco活化酶的分子生物學(xué)1.PEPC酶活的測(cè)定參照Ku等人的方法。在光照條件下，剪取轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的第五片葉0.1g左右，快速加入1.5ml蛋白質(zhì)提取緩沖液（50mM Tris-HCl，pH 7.0，10mM MgCl2，1mM EDTA，5mM DTT，5%聚乙烯吡咯烷酮，10%甘油），在冰上研磨至勻漿狀，將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml微量離心管中，415 000×g離心15 min，取上清轉(zhuǎn)移到新離心管中，此上清液即為酶粗提物。在室溫條件下檢測(cè)PEPCase活性，其檢測(cè)緩沖液為50mM tricine-KOH，pH 8.0，0.1 mMEDTA，1mM DTT，10mM MgCl2，10mMNaHCO3，3U NAD-蘋