銀染增強(qiáng)的納米金標(biāo)記探針對(duì)微量核酸的檢測(cè)

1、ISS N 100727626C N 1123870Q中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)2006年 11月 22(11 :919923 技術(shù)與方法銀染增強(qiáng)的納米金探針技術(shù)檢測(cè)微量核酸趙立凡 , 李柏生 , 黑笑涵 , 李曉波 , 李媛媛 , 徐順清3(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院 環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所 環(huán)境與健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 , 武漢 430030摘要 利用銀染增強(qiáng)的納米金技術(shù)建立了一種簡(jiǎn)單快速的核酸定量方法 . 該方法基于納米金與烷巰基修飾的寡核苷酸分子共價(jià)鍵合作用 , 將納米微粒報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在與靶核酸一端序列互補(bǔ)的寡 核苷酸上 , 同時(shí)生物素化修飾另一端互補(bǔ)序列 . 靶核酸與兩段寡核苷酸探針

2、雜交后 , 借親和素固定 在酶標(biāo)板孔內(nèi) , 通過(guò)納米金催化的銀染放大效應(yīng)產(chǎn)生高靈敏的識(shí)別信號(hào) , 適時(shí)記錄其吸光度值從而 實(shí)現(xiàn)核酸分子的定量 . 該檢測(cè)方法檢測(cè)單鏈核酸分子的靈敏度達(dá) 011fm ol L , 雙鏈分子為 10fm ol L. 關(guān)鍵詞 納米金 ; 核酸檢測(cè) ; 銀染增強(qiáng) 中圖分類號(hào) R115A Colorimetric B ased onN E nhancement2, X iao 2Han , LI X iao 2Bo , LI Y uan 2Y uan ,X U Shun 2Qing3K ey Laboratory o f Environment and H ealth ,

3、 School o f Public H ealth , Tongji Medical College o fHuazhong University o f Science and Technology , Wuhan 430030, China Abstract A sim ple g old nanoparticle 2based method to detect micro am ount of polynucleotide m olecules withsilver staining enhancement is established. Based on the covalence

4、action of thiol 2m odified olig onucleotides with nanoparticles , the nanoparticles was utilized as biomarkers to detect trace am ount of polynucleotides. T w o kinds of probes , which were respectively com plementary to one half of target polynucleotides , were labeled respectively with biotins and

5、 nanoparticles. The hybridization products of target polynucleotides with these tw o kinds of probes were imm obilized to microplates via avidin 2biotin system , and the signals of g old nanoparticles were subsequently am plified by silver staining s olution , and recorded with colorimetric abs orba

6、nce. This sandwich colorimetric assay can detect as few as 011fm ol L for single 2strand target polynucleotides and 10fm ol L for double 2strand target polynucleotides. K ey w ords g old nanoparticles ; polynucleotides detection ; silver staining enhancement收稿日期 :2006204207, 接收日期 :2006207211國(guó)家自然科學(xué)基金

7、資助項(xiàng)目 (N o 1203770173聯(lián)系人 T el :027283693417,E 2mail :xushunqingyahoo. com. cnReceived :April 07,2006;Accepted :July 11,2006Supported by National Natural Science F oundation of China (N o 1203770173C orresponding author T el :027283693417,E 2mail :xushunqing yahoo. com. cn 現(xiàn)知的人類疾病都與基因有著直接或間接的關(guān) 系 , 核酸的

8、檢測(cè)和分析在遺傳性疾病 、 傳染病和腫瘤 等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛 . 以往的方法大多是建立在 標(biāo)記有放射性核素 , 熒光或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的探針與 靶核酸序列雜交的基礎(chǔ)上 . 放射性標(biāo)記檢測(cè)體系需 要特殊培訓(xùn)的技術(shù)人員 , 且還會(huì)面臨放射性污染及 標(biāo)記活性受半衰期限制的問(wèn)題 . 而熒光標(biāo)記在其寡 核苷酸序列的制備及雜交檢測(cè)方面對(duì)儀器設(shè)備的要 求均較高 , 且熒光標(biāo)記物質(zhì)也比較昂貴 , 這是一般實(shí) 驗(yàn)室條件無(wú)法達(dá)到的 . 另外 , 雖然近年來(lái)核酸的擴(kuò)增 檢測(cè)技術(shù)迅速發(fā)展并廣泛應(yīng)用于臨床科研微生物學(xué) 檢測(cè)等 , 但這些檢測(cè)系統(tǒng)和方法往往存在擴(kuò)增量低 , 自身的引物設(shè)計(jì)和熒光素標(biāo)記探針?lè)爆?, 對(duì)設(shè)備要求

9、高及擴(kuò)增污染等缺陷 1, 限制了該擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù) 的應(yīng)用 . 因此特異核酸的檢測(cè)亟需建立一種快速 , 高 效 , 易于實(shí)施的檢測(cè)新方法 .近年來(lái)隨著納米技術(shù)的發(fā)展 , 一些基于寡核苷 酸修飾納米金標(biāo)記及其顆粒大小依賴的光散射 , 催 化作用及吸光特性等的核酸定量方法得以進(jìn)一步研 究 28. Mirkin 等利用納米金在以 DNA 片段為組裝 分子的引導(dǎo)下形成超分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn) , 建立了用納 米金標(biāo)記寡核苷酸探針并檢測(cè)特定多核苷酸序列的 新方法 , 為特定 DNA 序列檢測(cè)的研究和應(yīng)用開(kāi)辟了 一個(gè)新領(lǐng)域 . Mirkin 等通過(guò)納米金標(biāo)記兩套不同的 單鏈核酸探針同時(shí)與目的序列搭橋結(jié)合建立了一種 核

10、酸分析的方法 , 雜交后可形成聚合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) , 溶液 顏色隨之發(fā)生改變 , 通過(guò)銀染或滴加少量溶液至 C 18薄層 層 析 板 上 來(lái) 觀 察 信 號(hào) 的 改 變 9. 已 報(bào) 道 的Mirkin 等建立的方法檢測(cè)限是 50fm ol L 6. 而我們 發(fā)現(xiàn)目的核酸的濃度與銀染增強(qiáng)的納米金標(biāo)記探針 信號(hào)間存在良好的線性關(guān)系 , 在此基礎(chǔ)上建立了更 為簡(jiǎn)單靈敏的核酸定量的有效方法 , 檢測(cè)單鏈核酸 分子的靈敏度達(dá) 011fm ol L , 雙鏈分子為 10 fm ol L.1 材料與方法111 檢測(cè)微量核酸技術(shù)原理本研究目的在于建立一種靈敏度高 , 選擇性強(qiáng) 的核酸比色定量方法 , 該方法通過(guò)優(yōu)

11、化雜交條件利用親和素 2生物素系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)核酸的檢測(cè) (Fig 11 . 目的 核酸先與生物素標(biāo)記的互補(bǔ)探針及納米金標(biāo)記的互 補(bǔ)探針雜交 , 然后將雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)至親和素包被好的 酶標(biāo)板內(nèi) . 雜交緩沖液為 013m ol L NaCl , 0105%S DS ,10mm ol L 磷酸鹽緩沖液 , 雜交產(chǎn)物即可由親和素 2生物素作用錨定于固相載體酶標(biāo)板上 , 經(jīng) 1×P BS 和 2×P BN 溶液洗滌 5次后 , 再加銀染增強(qiáng)液 , 雜交信號(hào)隨之放大 , . 112 Fig. 1 The scheme of colorimetric method b ased on nanop

12、 articles with silver staining enh ancement(A Hybridization of the target polynucleotides with biotin 2labeled probes and g old nanoparticles 2functioned probes ; (B Imm obilization of the hybridization products to microplates via avidin 2biotin system ;(C Am plification of g old nanoparticle signal

13、s by silver enhancement s olution with the record of colorimetric abs orbance 烷 巰 基 標(biāo) 記 的 核 酸 序 列 購(gòu) 于 Invitrag onBiotechnical 公司 ,S eq1:5 2Bio 2gcagtT CC AGG CT CTT CT C A 23 (capturing probe Seq2:5 2TG CCCCGG AG TTG CG TG AG AAG AG CCT GG A 23 (target sequence Seq3:5 2CG C AACTCCGGGG C A 2(CH 2 62S

14、H 23 (nanoparticle probe Seq4:5 2TCC AGG CTCTTCTC ACG C AACTCCGGG G C A 23 (control sequence Seq1和 Seq3溶解于 TE 緩沖液 (10mm ol L Tris 2HCl , 1mm ol L E DT A , pH 714 . 中 ,Seq2和 Seq4直接溶解于超純水中 .直 徑 15nm 的 納 米 金 購(gòu) 于 Sino 2American Biotechnology 公司 .酶標(biāo)板 (C orning Star 購(gòu)于 G enetimes T echonolgy 公司 .AgNO 3, 檸

15、檬酸 、 檸檬酸三鈉及氫醌購(gòu)于生物工 程 (上海 有限公司 . 113 納米金標(biāo)記核酸探針的制備按照 Mirkin 2,Zhang 10等所述方法標(biāo)記納米金 探針 , 具體如下 :29中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào) 22卷a 膠體金溶液 500l ,4 14000r min 離心 20 min , 棄上清 ;b 加巰基標(biāo)記序列 (Seq3 100m ol L ,3l , 和 47l TE 緩沖液 , 混勻成 50l 體系 14 ,12h ; c 加等體積 (50l 012m ol L NaCl ,20mm ol L P B (20mm ol L Na 2HPO 4NaH 2PO 4,pH 710

16、, 使其終 濃度為 011m ol L NaCl , 10mm ol L P B , 迅速混勻 , 4 ,24h ;d 取上清 ,4 ,14000r min 離心 10min , 棄上 清 , 加 100l 超純水重懸后再次離心 , 棄上清 , 以去 除多余的未標(biāo)記上的單鏈核酸 ;e 加 100l 011m ol L NaCl ,10mm ol L P B (pH 710 混勻 , 置 4 儲(chǔ)存?zhèn)溆?.114 酶標(biāo)板包被親和素a 親和素 (1mg ml 用碳酸鹽包被液按 1 100稀釋 , 每孔包被 100l , 潮濕環(huán)境下 4 過(guò)夜 ; (鹽包被液 Na2C O 3, 0116g , 3g

17、, ml H 2O ,pH 916;b 1×P 4, 1 (V V T ween20 , 洗 滌 2次 , 拍干 .115 雜交a 雜交緩沖液 (013m ol L NaCl , 0101%S DS , 10 mm ol L P B (pH 718 20l , 生物素標(biāo)記探針 (Seq1 10 nm ol L ,10l , 不同濃度目的核酸 (Seq2 各 10l , 混 勻 ,25 ,10min ;b 加膠體金標(biāo)記探針 (Seq3 5l , 混勻 ,25 , 10min ;c 將該 45l 體系雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到各酶標(biāo)板 孔 ,37 保溫 20min , 傾倒干凈 ;d 1×

18、P BS 洗滌 1次 , 拍干 ,2×P BN (013m ol L NaNO 3and 10mm ol L Na 2HPO 4NaH 2PO 4,pH 710 洗 滌 2次 , 拍干 .116 銀增強(qiáng) (避光 取銀增強(qiáng)液 015g AgNO32ml H 2O , 12l ; 117g 氫醌 30ml H 2O ,300l ;2155g 檸檬酸 2135g 檸檬酸三鈉 10ml H 2O , 100l.后兩種溶液需新鮮配制 , 確保無(wú)結(jié)晶析出且無(wú) 色 , 氫醌和檸檬酸 (300l 100l 混和液應(yīng)在銀染前 30min 左右保持 37溫育 , 銀染用時(shí)再 加 12l AgNO 3迅速

19、混勻立即分加入各酶標(biāo)板孔內(nèi) , 每孔 100l , 放在溫箱里反應(yīng) . 反應(yīng)一定時(shí)間后 , 置入超純水 中 , 終止反應(yīng) .銀染增強(qiáng)反應(yīng)最好在避光或弱光下反應(yīng) , 以減 少銀自身成核反應(yīng) , 增強(qiáng)特異性 1113.117 酶標(biāo)儀檢測(cè) 630nm 處吸光度值2 結(jié)果211 單鏈核酸分子定量該方法檢測(cè)單鏈核酸分子簡(jiǎn)單快速 , 加入銀增 強(qiáng)劑可顯著放大膠體金標(biāo)記信號(hào) , 從而可檢測(cè)到極 低含量的膠體金 . 本方法對(duì)單鏈核酸分子的檢測(cè)限 可達(dá) 100am ol L (Fig 12 .2ange of the single 2strand target The silver enhance time i

20、s 150s在銀增強(qiáng)時(shí) , 我們觀察到隨著時(shí)間的推移 , 銀增 強(qiáng)液的灰度會(huì)不斷增加 , 尤其是通過(guò)雜交錨定于酶 標(biāo)板上的納米金顆粒可顯著加速銀顆粒的聚集 , 即 納米金銀染增強(qiáng)信號(hào)的吸光度值變化是劑量時(shí)間依 賴性的 (Fig 13 . 在一定的時(shí)間控制下 , 銀增強(qiáng)的灰 度值變化與不同濃度目的核酸序列 (Seq2 雜交系中 固定于酶標(biāo)孔內(nèi)的納米金顆粒的量呈正相關(guān) . 通過(guò) 一系列實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 , 選擇出最合適的時(shí)間段 100 150s 終止銀染 , 得出銀增強(qiáng)吸光度值與不同濃度目 的核酸分子的良好線性關(guān)系 (Fig 14 .212 雙鏈核酸的定量本研究的核酸比色定量方法依賴于單鏈核酸的 選擇性互

21、補(bǔ)雜交 , 因此 , 為了對(duì)雙鏈核酸分子進(jìn)行定 量 , 先要在加入探針前進(jìn)行變性 , 探針與變性的原單 鏈互補(bǔ)核酸分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到目的單鏈核酸分子上 , 加入過(guò)量的納米金標(biāo)記探針和生物素標(biāo)記序列以使 探針雜交競(jìng)爭(zhēng)超過(guò)原互補(bǔ)序列 , 而且通過(guò)選擇性結(jié) 合和洗滌 , 可以很大程度上去除未結(jié)合的探針 , 從而 顯著降低背景值 .實(shí)驗(yàn)中 , 雙鏈核酸分子 (Seq2 Seq4 (10l , 不同 濃度 先 95 變性 3min , 然后將 EP 管迅速加入干 冰 異丙醇冰浴 3min , 再加入 10l 生物素標(biāo)記的探 針液 (Seq1, 100nm ol L , 10l 納 米 金 標(biāo) 記 探 針 (

22、Seq3 , 及 20l 2×雜交緩沖液 , 室溫下溫育 20 min , 后續(xù)程序同單鏈檢測(cè) . 目前雙鏈檢測(cè)核酸最低 129第 11期 趙立凡等 :銀染增強(qiáng)的納米金探針技術(shù)檢測(cè)微量核酸 Fig. 3 The time 2absorb ance (A relationship of various concentrations of target oligonucleotide with silver staining enh ancement( BFig. 4 Correlation betw een the absorb ance values of silver enh an

23、cement and concentrations of target single 2strand sequenceThe controlled silver enhance time was 150s and the concentrations of target sequence varied from 1pm ol L to 100am ol L. Values represent x ±s of independent triplicate determinations.檢測(cè)限為 10fm ol L (Fig 15,6 .Fig. 5 The time 2absorb a

24、nce relationship of various concentrations of double 2strand polynucleotides with silver staining enh ancement實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 , 觀測(cè)到的信號(hào)增強(qiáng)是由目的核 酸特異性雜交的結(jié)果 . 在無(wú) Seq2情況下 , 膠體金標(biāo) 記的探針并不會(huì)與生物素標(biāo)記序列非特異性結(jié)合 , 在加 Seq4而不含 Seq2的陰性對(duì)照組中 , 亦無(wú)明顯Fig. 6 Correlation betw een the absorb ance values of silver enh ancementandconcentr

25、ationsofdouble 2 strandpolynucleotides (Seq2 Seq4The controlled silver enhance time was 150s and the concentrations of target polynucleotides varied from 100pm ol L to 10fm ol L. Values represent x ±s of independent triplicate determinations.信號(hào)增強(qiáng) .3 討論基于寡核苷酸探針共價(jià)連接的可在不同條件下顯示色度信號(hào)變化的納米金技術(shù) ,Mirkin

26、等將納米 金標(biāo)記的核酸探針與互補(bǔ)目的序列雜交成多聚網(wǎng)絡(luò) 結(jié)構(gòu) , 膠體金溶液顏色隨之由紅色變藍(lán) 14,15, 從而檢 測(cè)目的核酸的量 . 該體系的顏色變化給出的雜交信 號(hào)依賴于聚合凝聚體中納米金之間的距離 , 因而納米金聚合網(wǎng)絡(luò)形成時(shí)的沉降會(huì)影響終點(diǎn)的觀察 16. 本研究利用生物素標(biāo)記寡核苷酸序列作為固相末 端 , 將納米金標(biāo)記探針與互補(bǔ)的目的核酸共雜交產(chǎn) 物錨定于固相載體上 , 可有效避免納米金溶液體系 中聚合網(wǎng)絡(luò)沉降對(duì)觀察終點(diǎn)的干擾 , 與銀染法結(jié)合 更提高了檢測(cè)的靈敏度 .銀增強(qiáng)納米金檢測(cè)痕量核酸的方法將目的核酸229中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào) 22 卷與納米金標(biāo)記探針及生物素標(biāo)記探針充

27、分雜交后再 將該特異性雜交產(chǎn)物捕獲到固相載體酶標(biāo)孔內(nèi) , 使 得雜交條件得以充分優(yōu)化從而提高了檢測(cè)靈敏度 . 而已有的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中探針多固化在聚丙烯薄片 上再進(jìn)行雜交 , 如此會(huì)影響雜交效率 , 降低檢測(cè)靈 敏度 .納米金標(biāo)記銀增強(qiáng)方法不僅發(fā)揮了納米金標(biāo)記 的優(yōu)勢(shì) , 更利用了銀染增強(qiáng)技術(shù)將信號(hào)有效放大 . 但 值得注意的是 , 銀染中銀原子的自身聚合所引起的 一定背景值會(huì)干擾納米金催化的銀增強(qiáng)效應(yīng)的觀 察 , 只有在信號(hào)擴(kuò)增曲線的指數(shù)期相才可以獲得吸 光度值與目的核酸濃度之間良好的梯度關(guān)系 . 若銀 染時(shí)間過(guò)長(zhǎng) (超過(guò) 5min , 則銀染強(qiáng)度均到達(dá)平臺(tái) 期 , 不能區(qū)分梯度關(guān)系 . 因此

28、 , 銀增強(qiáng)時(shí)間控制在時(shí) 間 2吸光度值曲線指數(shù)相內(nèi) , 多次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后一般選 擇 100150s.,.子兩端互補(bǔ)結(jié)合 , 生成 5 端標(biāo)記生物素和 3 端標(biāo)記 納米金的雙鏈核酸分子 . 當(dāng)雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)移入包被有 親和素的酶標(biāo)孔內(nèi) , 經(jīng)溫育后 , 標(biāo)有生物素的雙鏈核 酸即被捕獲 , 未結(jié)合的過(guò)量探針被洗滌去除 . 通過(guò)銀 染增強(qiáng) , 結(jié)合在酶標(biāo)孔上的納米金標(biāo)記信號(hào)即可放 大 105倍 , 從而使得納米金標(biāo)記肉眼都可粗略觀察 到 . 通過(guò)檢測(cè)其銀染吸光度值可以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn) 行定量檢測(cè) .該納米金標(biāo)記銀增強(qiáng)檢測(cè)方法檢測(cè)單鏈核酸的 靈敏度為 011fm ol L , 雙鏈為 10fm ol L ,

29、 方法快速簡(jiǎn) 便 、 靈敏度高 , 約 60min 即可完成一次檢測(cè) , 且不需 要特殊儀器或 PCR 擴(kuò)增 , 可直接檢測(cè)樣本中微量的 病原體 DNA , 其顯著優(yōu)勢(shì)在于甚至用肉眼觀察即可 獲得半定量結(jié)果 , 因而適用于大量生物樣本的初篩 , 對(duì)感染性病原體或遺傳性疾病進(jìn)行快速檢測(cè)及鑒 定 , 可望在基層廣泛推廣 .參考文獻(xiàn) (R eferences 1 G iulietti A , Overbergh L , Valckx D , et al . An overview of real 2time quantitative PCR :applications to quantify cyt

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