葉綠體轉基因方法

1、葉綠體轉基因方法，超表達和純化人血清白蛋白，蛋白質很容易受到蛋白降解艾麗西亞費爾南德斯 - 圣米1，天使明戈卡斯特2，邁克爾米勒3，和亨利丹尼爾1，*分子生物學的佛羅里達州中部，生物分子大學1系和微生物學，科學樓20，336室，奧蘭多，佛羅里達州32816-2360，USA農業(yè)生物技術和自然資源的納瓦拉，CSIC的公立大學2研究所，Mutilva巴哈31192西班牙納瓦拉3奧本大學研究儀器設備 - 先進的顯微及成像實驗室，赤褐色，AL 36849，USA概要人血清白蛋白（HSA）占血清中總蛋白的60，它是最廣泛使用的靜脈內的蛋白質中的一些人的療法。 HSA，但是，目前提取的只有從血液因為缺乏商

2、業(yè)上可行的重組表達的系統。 HSA是高度敏感蛋白水解降解在重組系統和是昂貴的凈化。 HSA使用的Shine-Dalgarno順序在轉基因葉綠體表達（SD），這通常有利于超表達轉基因，導致在僅在0.02的HSA總蛋白（TP）。使用葉綠體非翻譯HSA調節(jié)序列的修飾區(qū)（UTR）導致了過度表達的HSA（最高達11.1，TP）的，補償過度蛋白水解降解。這是藥物蛋白在轉基因表達最高植物和500倍高于轉基因葉子HSA表達以前的報告。電子對免疫標記的轉基因葉綠體的顯微照片顯示HSA包涵體，這提供了用于從其它細胞蛋白純化的簡單方法。 HSA包容機構可以很容易地溶解，以便獲得用適當的試劑以單體形式。該在這項研究中

3、使用的調節(jié)元件應作為一個模型系統用于增強的表達外源蛋白是高度敏感的蛋白水解降解，并提供在優(yōu)勢純化，包涵體形成的時候。關鍵詞葉綠體基因工程;生物制藥;轉基因作物;分子農業(yè);重組人血蛋白介紹可用性重組人蛋白發(fā)生了革命性的使用治療寶貴的蛋白質在臨床醫(yī)學。植物提供了一個合適的替代微生物或因為它們的價格低廉的生產生物藥物蛋白質的動物表達成本和不存在的人類病原體。但是，也有一定的局限性。尤其是，2003 Blackwell出版有限公司*通訊（傳真+1 407 823 0956; ）。美國國立衛(wèi)生研究院公共訪問作者手稿植物生物工程學家作者的手稿;可在PMC 2012年1

4、0月26發(fā)表在最后的編輯形式：植物生物工程學家2003年3月; 1（2）：71-79。 DOI：10.1046 / j.1467-7652.2003.00008.x。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿核轉基因植物的人類蛋白質的表達已經低得令人失望，例如：人血清白蛋白的總可溶性蛋白（TSP）的0.02，人干擾素0.000017鮮重，人表皮生長因子茶匙和促紅細胞生成素0.00260.001茶匙（丹尼爾等，2001D）。因此，為了增加在表達水平是很重要為了利用植物生產藥用重要的蛋白質。作為替代核表達，葉綠體轉基因的方法已經開發(fā)作為有效的工具，生物制藥的蛋白質在植物中的表達（

5、丹尼爾和Dhingra，2002;丹尼爾等人，2001年，B; DeGray等人，2001;阿骨打等人，2000;的Staub等人，2000）。基于高分子蛋白質的表達與第一示范后，多樣的醫(yī)療應用（阿骨打等人，2000），轉基因葉綠體已經顯示快遞非常小的抗菌肽沒有融合蛋白（DeGray等人。，2001），裝配官能低聚物與霍亂毒素亞單位的二硫鍵（丹尼爾等人，2001年b），和表達的單克隆抗體與協同表達和裝配的重和輕鏈與正確折疊和形成二硫橋的（丹尼爾等人，2001年），這表明適當的氧化還原環(huán)境或需要伴侶蛋白是本在葉綠體中。功能的人類生長激素在轉基因煙草中的表達葉綠體證實葉綠體能夠人類蛋白的正確折疊的

6、用二硫鍵（的Staub等人，2000）。表達多基因在一個單一的能力轉化事件（丹尼爾和Dhingra，2002;德小筑等，2001），積累非常大量的外來蛋白質（德小筑等，2001），成功番茄有色體用于水果高水平轉基因表達的工程（聯陣等人，2001年），其耦合到超表達疫苗抗原（丹尼爾。等，2001年b），以及使用植物來源的無抗生素選擇標記（丹尼爾等人，2001年c），好兆頭口服交貨可食用疫苗和生物制藥是目前鞭長莫及那些誰最需要它們。此外，葉綠體基因工程是一個環(huán)保的方式，提供了轉基因的遏制和解決基因沉默和核轉基因植物（Bogorad，2000遇到位置效應;丹尼爾和Dhingra，2002;丹尼爾等人

7、，2002年;丹尼爾，2002）。HSA是最廣泛使用的靜脈內蛋白質和被規(guī)定在multigram數量在創(chuàng)傷和其它各種臨床情況（彼得斯，1995年），以取代血容量。HSA是單體球狀前原蛋白，其成熟形式由一個單一的585個氨基酸的多肽鏈（66.5 kDa的17個二硫鍵）。每年世界需要超過500噸占超過$ 1.5十億市值。至今，白蛋白已經主要生產的血清的分餾。缺乏糖基化有助于生產官能的HSA原核系統中。雖然HSA基因和cDNA已被表達在多種微生物系統，其中包括大腸桿菌（拉塔等人，1987），枯草芽孢桿菌（Saunders等人，1987），釀酒酵母（夸克等人，1989），克魯維（冷嘲熱諷等人，1991）

8、或畢赤酵母（大谷等人，1998），沒有系統尚未商業(yè)上可行的。 Sijmons等人。 （1990）取得的第一報告試圖表達HSA在轉基因植物，但非常低的表達水平達到（0.02TSP）。 HSA無法檢測，如果在細胞質中表達，提示該蛋白質在該隔室并不穩(wěn)定，由于高敏感性的蛋白水解降解。有10倍增加的HSA累積已經最近報道通過核馬鈴薯植物的轉化和靶向于HSA的塊莖質外體（法倫等。，2002年）。估計行業(yè)，然而，表明具有成本效益的產量藥品生產是每克鮮重0.1毫克的HSA（法倫等人，2002）。此外，良好的重組系統中仍然沒有可用的許多人類蛋白質是昂貴的純化或高度易感對蛋白水解降解。已知的是傳統使用的列生物藥品

9、的純化占30生產成本和的設置成本的70（佩德里迪斯等人，1995）。蛋白水解降解文瀾等。第2頁植物生物工程學家作者的手稿;可在PMC 2012 10月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿另一個嚴重的問題，工業(yè)生物處理。日益增加的生產蛋白質的在通過使用重組DNA技術的異源宿主帶來這問題成為關注的焦點;異源蛋白顯得更容易蛋白水解（Enfors，1992年）。重組蛋白質通常通過細胞視為外國，因此降低比大多數內源性蛋白（Rozkov等人，2000）要快得多。的蛋白水解穩(wěn)定性重組蛋白是影響最終產量一個顯著因子。本研究試圖開發(fā)重組體HSA的生產更有效的方法，其可以用作模型系

10、統，以豐富或純化來自生物制藥蛋白轉基因植物，這是高度敏感的蛋白水解降解。結果與討論兩個葉綠體轉化載體被設計具有不同5調節(jié)序列指導HSA表達和轉基因最大化蛋白積累葉綠體。 PLD的基本載體，在這個實驗室葉綠體轉化開發(fā)，使用（丹尼爾等人，1998;丹尼爾等人，2001年b;德科薩等人，2001;阿骨打等人，2000;哥打等人，1999）。在質粒pLDAsdHSA（圖1a），所述的aadA基因，其賦予壯觀霉素抗性，和HSA的基因被表達為從質多順反子Prrn啟動子。閃耀 - 達爾加諾（SD）共有序列GGAGG放在上游的兩個基因。葉綠體高水平的外源蛋白的表達（TSP的3-21）有研究表明，使用該5序列不

11、同的蛋白質（丹尼爾等人，2001年b; DeGray等人，2001;哥打等人，1999）。在pLDApsbAHSA向量（圖1a），在204 bp的煙草插入含有啟動子和體psbA 5UTR葉綠體DNA片段立即于HSA編碼序列的上游并且所述的aadA基因的下游。它是眾所周知，psbA啟動子和非翻譯的控制下的外源基因區(qū)域被表達以非常高的水平（丹尼爾等人，1990）。這增強翻譯可能是由于在5UTR元件（EIBL等人，1999）。載體如先前所述（丹尼爾，1997）并轟擊到煙草葉子，5周后，幾個主芽出現從每個轟擊葉片作為獨立的結果轉化事件。推定的轉化的枝條上500微克/毫升確定增長對大觀霉素。外來基因盒引

12、入所述葉綠體基因組的整合通過PCR確認篩選主芽。該戰(zhàn)略使用的土地一個引物在本機相鄰的結合點和上的aadA第二引物葉綠體基因組基因。該PCR產物不能在核轉基因植物或自發(fā)獲得突變體，從而這兩種可能性可以消除。結果發(fā)現，90的總枝條得到的是真實的葉綠體轉化。證實轉化體進行一第二輪大觀霉素選擇來實現同質性。他們植根于大觀霉素的存在下，然后轉移到盆中用于進一步表征。南方的進行印跡分析，以選擇同質性T 0的線，并確認穩(wěn)定維持的在T 1代轉基因整合（圖1b-d）中。側翼區(qū)的探針（P1）的確定了未轉化的對照植物中7.45千堿基的片段，如預期的（圖1c）。在葉綠體轉基因系中，只有轉化的基因組拷貝的觀察所證明由1

13、0.5和10.7 kb的雜交的pLDAsdHSA和pLDApsbAHSA片段轉基因系，分別。要確認10.5和10.7 kb的片段包含在HSA的基因，同樣的印跡再次探測與HSA P2探頭。正如預期的，雜交檢測只在葉綠體轉基因系（圖1d）。其他的缺失雜交片段消除同核與葉綠體積分事件轉基因株系。文瀾等。第3頁植物生物工程學家作者的手稿;可在PMC 2012 10月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿HSA數量在轉基因煙草葉綠體ELISA法檢測。一個多植物轉化的之間觀察HSA積累360倍的差異兩個不同的載體（圖3a）：0.02和7.2TP在pLDAsdHSA和pLDAp

14、sbAHSA轉基因系，分別。葉綠體結構與SD序列已證明直接CTB的表達非常有效（最多茶匙的4;丹尼爾等人，2001年b）。類似構建體，但在質體基因組的其它區(qū)域插入，也已經成功（3-21小勺; DeGray等人，2001;哥打等人，1999），這表明高蛋白質表達水平可以通過使用這個結構中的操縱子帶的SD來實現序列。因此，HSA表達水平低，在pLDAsdHSA轉基因植物可以不能因的調控信號的構建體的效果。在的量的差異HSA可能是由于轉錄后，翻譯或翻譯后的效果。學習在HSA表達的差異，轉錄豐度進行了檢查，RNA印跡，這是使用3psbA基因區(qū)域的探針（圖2）執(zhí)行。該5psbA / HSAmonocis

15、tron成績單遠遠比的aadA / SD / HSA dicistron更豐富，但這樣的差異不顯示與HSA 360倍的差異線性相關這兩個轉基因株系之間積累。這種缺乏轉錄物之間的相關性豐度和蛋白質積累已報道從幾個實驗室當psbA基因5UTR被使用（梅菲爾德等人，1995;的Staub和Maliga，1993，1994年），這意味著一個在5UTR的psbA在提高翻譯的重要作用。 EIBL等。 （1999年）也表明，缺失psbA基因5UTR的末端序列的降低的能力非編碼區(qū)，以增強翻譯。因此，在轉基因pLDApsbAHSA有效翻譯線可能在建立高水平的HSA積累的一個重要因素。有幾個研究，表明psbA基因

16、5UTR賦予光依賴翻譯不僅給體psbA基因（Zerges，2000），而且還與其他異源蛋白（EIBL等人，1999;的Staub和Maliga，1993，1994年）。 HSA下的psbA基因表達因此5UTR調控預期要輕有關。變化HSA積累后照明的不同時期通過ELISA（圖3b）監(jiān)測。 HSA數量被觀察到的最大可達成熟連續(xù)照明（TP的11.1）的50小時連續(xù)葉和2-4倍的下降是8小時黑暗時期后觀察。在這樣的差別HSA積累了十分明顯，它是通過檢測凝膠染色用考馬斯亮藍（圖3c）。的Staub和Maliga（1993年，1994年）和EIBL等。 （1999）表明雖然翻譯是在黑暗中被逮捕，該5psb

17、A / uidA基因mRNA的營業(yè)額非常低。此觀察通過Northern印跡分析，其顯示沒有大的確認對HSA亮和暗量5psbA / HAS轉錄之間的差異（圖2，泳道3，4）。因此，在黑暗與光明之間的HSA積累的差異不可能是由于在轉錄或轉錄穩(wěn)定性的速率來逮捕的差別，但由于翻譯在黑暗中和HSA的在葉綠體的營業(yè)額。從轉化的植物蛋白分離，研究HSA積累的圖案在轉基因葉綠體。蛋白質印跡證實HSA數量差異其中轉基因系（圖3d）。在pLDApsbAHSA轉基因品系，人血清白蛋白是部分地溶解與用于總蛋白提取的標準緩沖液中。這一觀察建議形成HSA的內部聚集在pLDApsbAHSA轉基因葉綠體轉化。電子顯微鏡和免疫

18、膠體金標記，因此是在執(zhí)行轉化和非轉化植株進一步展開調查。正如預期的那樣，電子葉組織的顯微照片中顯示形成大的聚集體或包涵體pLDApsbAHSA轉基因葉綠體成熟轉化植物（圖4b-d）中。它是有趣地注意到，含有包涵體葉綠體中尺寸增大到HSA容納大量堆積（對比圖4a，D）。然而，表型這些植物的表現正常（圖5）。 HSA的pLDAsdHSA轉基因量葉綠體是如此之低，這是不能夠檢測上述免疫標記背景。在葉綠體大小沒有顯著變化，觀察在這些植物中。文瀾等。第4頁植物生物工程學家作者的手稿;可在PMC 2012 10月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿包涵體已經于原核生物和真核

19、生物的胞質溶膠被經常觀察當異源蛋白的過表達。在該功能的發(fā)生葉綠體首先報道了Ketchner等。 （1995年）。眾所周知該蛋白質聚集成包涵體大多涉及的部分分子間的關聯折疊中間體（Mitraki和King，1989）。高蛋白質濃度通常會導致條件經常超出正常的溶解度極限。即使是最豐富的蛋白質光合細胞，RUBISCO，形成了在某些情況下，包涵體。許多自養(yǎng)細菌和藍藻的所有包了很多RUBISCO到包容機構積極參與二氧化碳，被稱為羧的固定（夏夫利和英國，1991年）。我們的假設的基礎上，包涵體形成的過程中，是在對比pLDAs-DHSA轉基因品系，HSA下psbA基因5UTR合成形成大聚集體主要是由于該蛋白

20、質的高局部濃度。包涵體形成是策略之一用于減少不穩(wěn)定的蛋白水解重組蛋白（Enfors，1992）。大多數重組蛋白質的研究有被證明是對蛋白水解包涵體內高抗。雖然有包涵體內免受蛋白酶，有些蛋白水解也可以發(fā)生直接在聚集蛋白（Carrio等人，1999）。 HSA也似乎是易感轉基因葉綠體中的某些蛋白水解降解。然而，凈余額合成與降解之間是非常有利的，特別是在幾個小時連續(xù)照明。正確折疊的HSA可以從包涵體變性完成后痊愈增溶和體外重折疊。從包涵體正確再折疊的HSA是一個已在數項研究用大腸桿菌先前已經證明常規(guī)程序（拉塔等人（1987）和釀酒酵母（劉天妮等人，1996;。夸克等人，1989年）。在這些情況下，人的

21、和重組的HSA重折疊進行比較，這是示這兩種蛋白質在結構上等價的，這表明HSA可以是從包涵體回收并正確折疊。繼這些準則協議，HSA從轉基因葉綠體中提取。圖6a顯示染色銀SDS-PAGE凝膠，其中HSA包涵體可以從可溶級分中分離（泳道3），其中大部分的細胞蛋白質被發(fā)現。列入溶解后機構和后續(xù)的復性，HSA可以完全轉化為單體形式（圖6a，第5泳道，圖6B，泳道5）。我們的HSA的估計收益率的結束協議是約20的初始量在葉子，雖然報告協議具有在實驗室規(guī)模被執(zhí)行，并且可以用于工業(yè)進一步優(yōu)化制作。據估計的HSA在轉基因植物中表達，以符合成本效益與表達低至0.1毫克人血清白蛋白/克鮮重的水平（法倫等人，2002

22、）。該回收率溶解包涵體并復性的HSA后的約0.25毫克HSA /克鮮重（不含可溶性的HSA在轉基因葉綠體），這超過了成本制藥工業(yè)的有效估計。之一的這項研究的主要目標是開發(fā)一種更有效的表達系統人血清白蛋白，一個重要的人類的治療性蛋白是高度敏感的降解。 HSA的SD的平移控制在成熟的植物表達序列導致HSA積累的非常低的水平，可能是由于過度的蛋白降解和翻譯不佳率。然而，當根據所表達的psbA啟動子和5UTR的控制下，最多在HSA積累500倍增加是在成熟植物觀察到的相比，測試的其它調節(jié)序列。 HSA是觀察到形成大包涵體，結果即使在的尺寸的顯著增加轉基因葉綠體和推測蛋白水解提供保護，HSA降解。包涵體從

23、其它細胞蛋白促進的HSA純化。HSA的分子具有的化學和結構功能，而不是酶活性，文瀾等。第5頁植物生物工程學家作者的手稿;可在PMC 2012 10月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿因此，復雜的研究是必要的，以充分展示的功能分子（參見劉天妮等人，1996;大谷等人，1998; Petersen等人，2000; Tarelli等人，1998年; Watanabe等人，2001，b）中。使用體外這樣的功能性研究重折疊的HSA是在進展。實驗步驟葉綠體表達載體pLDAsdHSA是通過將人血清白蛋白的1.8kb的EcoR構造/還不I片段進在PLD載體的多克隆位點（丹尼爾

24、等人，1998;丹尼爾等人，2001年b;德科薩等人，2001;鼓達等人，2000;哥打等人，1999）。這個片段含有成熟HSA編碼序列之前的Shine-達爾加諾（GGAGG），它具有的ATG作為起始密碼子。這些序列進行了介紹，通過使用引物：5-GGAGGCAACCATGGATGCACACAAGAGTGAAGG-3。對于pLDApsbAHSA載體中，204 bp的序列包括啟動子和5UTR psbA啟動，通過擴增使用煙草DNA為模板PCR。下列引物：5-CCGTCGACGTAGAGAAGTCCGTATT-3和5-GCCCATGGTAAAATCTTGGTTTATTTA-3。融合與HSA的基因在做的

25、Nco位點放置在psbA基因5UTR的3端，然后插入到PLD矢量作為一個生態(tài)RI /沒有我的片段。在繼續(xù)轟擊，載體通過測試Western印跡分析在大腸桿菌中。轟擊和再生無菌煙草（栽培品種佩蒂特哈瓦那）葉使用Bio-Rad公司轟擊的PDS-1000 /赫如先前所述生物射彈裝置（丹尼爾，1997）。轟擊葉片進行兩輪選擇的含有500微克/毫升的壯觀霉素的RMOP培養(yǎng)基上再生轉化體（丹尼爾，1997）。再生后，將植物扎根于500微克/毫升大觀霉素（丹尼爾。等，2001年b），并轉移到在生長室的盆。光照周期為16小時光照和8小時黑暗。PCR和Southern blot分析PCR方法分析整合不同盒在轉化的

26、植物為描述（丹尼爾等人，2001年b角;德科薩等人，2001;哥打等人，1999）。對于Southern印跡分析，總DNA從轉化的和未轉化的植物的葉中提?。≦iagen公司的DNeasy試劑盒）?？侱NA（5微克）溶液用Bam HI消化，電泳上0.7瓊脂糖凝膠，并轉移到尼龍膜上（DURALON紫外線Stratagene）中。模板用于探測側翼序列是0.81 KB的Bgl/巴姆HI片段和HSA 0.75 KBNCO我片段。該探針使用寡聚標記過程用32 P標記-的dCTP（蓄勢待發(fā)，Amersham公司）。探針雜交到繼所述膜QUICK-HYB協議（DURALON紫外線，Stratagene公司）。N

27、orthern blot分析總RNA從轉化和未轉化的植物的葉中提?。≧Neasy試劑植物試劑盒，Qiagen公司）。核糖核酸2.5微克進行電泳上1.2瓊脂糖/甲醛凝膠然后轉移到尼龍膜上（Stratagene）中。的0.21 KB的Xba/ PST I片段3的psbA基因用作探針，并使用寡聚標記用32 P標記-的dCTP過程（Amersham）上。HSA定量對ELISA人血白蛋白定量試劑盒（BETHYL Laboratories公司）進行。轉化和未轉化葉（100毫克）的下一個16小時生長的盆栽植物文瀾等。第6頁植物生物工程學家作者的手稿;可在PMC 2012 10月26日。NIH-PA作者手稿N

28、IH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿光周期磨碎在液氮中，再懸浮于700微升50毫NaOH和分析根據制造商的協議。轉基因葉的萃取物稀釋，以適應在所提供的人血清白蛋白標準的線性范圍。吸光度在450nm讀數。該DC蛋白質測定法（Bio-Rad公司）來測定總溶解的蛋白質。SDS-PAGE和免疫印跡分析轉化的和未轉化的葉（100毫克）研磨在液氮中再懸浮于200微升的蛋白質提取緩沖液（200mM的Tris-鹽酸pH為8.0，100毫氯化鈉，400mM的蔗糖，14毫ME，0.05吐溫20，0.1SDS中，10毫摩爾EDTA，2毫PMSF）。葉的萃取物在煮沸樣品緩沖液（Bio-Rad公司）并電泳在10聚丙烯

29、酰胺凝膠。分離的蛋白用考馬斯亮藍G-250或轉移到硝酸纖維素膜免疫印跡。第一抗體（兔抗HSA，北歐免疫學），使用以1：10 000稀釋，和二次抗體（堿性磷酸酶結合的抗兔鼠，適馬或羊抗兔HRP共軛，南方生物技術）在1：15 000堿性磷酸酶顏色發(fā)展的試劑，BCIP / NBT，在AP顯色緩沖液（Bio-Rad公司），或電致化學發(fā)光試劑盒（Amersham）被用來進行檢測。包涵體溶解可溶性蛋白除去用在0.2M NaCl的，的25mM Tris - 鹽酸pH值的第一提取7.4，2mM的PMSF和0.1的Triton X-100。離心60分鐘，在20 000個克后，將沉淀溶解16小時，在4在6M的谷鹽

30、酸，0.1MME和0.25mM的Tris-鹽酸pH為7.4。離心60分鐘，在20 000個克后，將上清液再慢慢稀釋100倍于100mM氯化鈉，的50mM的Tris-HCl pH 8.5的和1mM EDTA，在4下24小時。餾分進行電泳在SDS-PAGE 10凝膠，銀染色，Bio-Rad公司試劑和協議。透射電子顯微鏡和免疫膠體金標記與未轉化和轉基因植物幼苗和成熟葉進行分析。固定和免疫標記的電子顯微鏡所描述的執(zhí)行Vrekleij和Leunissen（1989）。切片第一阻塞，培養(yǎng)1小時與山羊抗人白蛋白多克隆抗體（北歐免疫學;稀釋范圍為1：1000至1：10 000），然后溫育2小時用兔antig-

31、燕麥IgG二抗共軛至10nM金稀釋1：40在封閉溶液。切片檢查中于60千伏蔡司EM 10透射電子顯微鏡。致謝這項研究是由美國國立衛(wèi)生研究院從RO1 GM 63879和Chlorgen公司以高清和“Direccin補助部分支持一般德INDUSTRIA，總統府納瓦拉“（西班牙）和AMC整合的轉基因盒到葉綠體基因組和同質性的研究。 （一個）地區(qū)同源重組的強調了本土葉綠體基因組。HSA是通過插入aadA基因的Prrn啟動子上游驅動所有盒如在所描述的壯觀霉素與另外的啟動子和控制元件的電阻文本。拖曳內箭頭表示轉錄方向。數字向右指示當用Bam HI消化總DNA被探測與所預測雜交片段探頭P1。 （二）0.81

32、千對堿基片段（P1）的側翼盒和0.75千堿基的片段含有HSA編碼區(qū)（P2）分別用作探針的Southern印跡分析。 （光盤）Southern blot分析。 1：未轉換的DNA; DNA的植物轉化的：2,3：文瀾等。第10頁植物生物工程學家作者的手稿;可在PMC 2012 10月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿pLDAsdHSA; 4,5：pLDApsbAHSA。植物對于第一（T 0）和第二（T 1）代進行了分析。 2,4：T 0的一代。 3,5：T已1代。探測印跡用P1（c）和P2的（四）。 AADA：氨基糖苷類3腺苷酸轉移; KB：千堿基;病人：啟動子; Prrn啟動：16SrRNA基因啟動子; SD：閃耀 - 達爾加諾。轉基因植物的轉錄模式。與執(zhí)行的Northern印跡分析總RNA提取盆栽植物的葉子。 3的psbA基因的用作探測。 1：未轉化的植物; 2：轉化pLDAsdHSA; 3：轉化pLDApsbAHSA后照明或4：在黑暗中。溴化乙錠染色的rRNA是用于評估負載。鑒定轉錄物顯示在右邊。的方