分析儀器基本知識(shí)

1、液相色譜基本常識(shí)一色譜法的原理利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解,分配,吸附等化學(xué)作用性能的差異,當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離。兩相中有一相是固定的,叫作固定相,也就是咱們的色譜材料；有一相是流動(dòng)的,稱(chēng)為流動(dòng)相,流動(dòng)相又叫洗脫劑。二色譜類(lèi)型氣相色譜(Gas Chromatography, GC)-用氣體作為流動(dòng)相(又叫載氣)。 液相色譜(Liquid Chromatography, LC)-用液體作為流動(dòng)相(又叫洗脫劑)。2.按固定相的形態(tài)分:（1）平面色譜：紙色譜、薄層色譜。（2）柱色譜三定義高效液相色譜法：是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜,基于儀器方

2、法的高效能分離手段。組成：高性能色譜柱，高精度輸液泵，高靈敏度檢測(cè)器優(yōu)點(diǎn)：高效(60000理論塔板/米)、高速(110mL/min)、高靈敏度（微升數(shù)量級(jí)），高壓(150300kg/cm2)、高精度、高自動(dòng)化高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。 缺點(diǎn)：儀器設(shè)備價(jià)格昂貴19世紀(jì)70年代中期，HPLC儀開(kāi)始出現(xiàn)，主要填料：10 m 的無(wú)定型硅膠顆粒。70年代后期，發(fā)展了反相液相色譜。80年代，HPLC 被廣泛應(yīng)用于化合物的分離，主要填料：粒徑為5 10m 球形硅膠。90年代早期，粒徑為5 m 的高純硅膠，即所謂的B 型硅膠被發(fā)展，并成為這個(gè)行業(yè)填料的標(biāo)準(zhǔn)，這種B 型硅膠含有微量的金屬

3、。90年代后期，為了滿足快速分離的需求，發(fā)展了3 m 或3.5 m 的球形硅膠，其作用和性能逐漸的獲得了人們的認(rèn)同和接受。21世紀(jì)早期，為適應(yīng)超快速的分離要求，粒徑小于2 m 的填料被開(kāi)發(fā)出來(lái)，發(fā)展出了整體柱、無(wú)機(jī)和有機(jī)雜化硅膠。目前，市場(chǎng)上流行的分析用的HPLC 硅膠基質(zhì)填料主要為B 型硅膠。4. 高效液相色譜柱的基質(zhì)材料（1）硅膠優(yōu)點(diǎn)：目前應(yīng)用最為廣泛的基質(zhì)材料。高機(jī)械強(qiáng)度和高的比表面積?？衫弥苯拥膹V泛的表面鍵合反應(yīng)來(lái)滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求。重現(xiàn)性好。pH 適用范圍為pH 28。缺點(diǎn)：具有容易導(dǎo)致強(qiáng)堿性物質(zhì)拖尾的，表面活性和帶酸性的硅羥基。（2）聚合物

4、：交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯 優(yōu)點(diǎn)：pH 穩(wěn)定性好：pH113?？梢栽诤軐挼姆秶鷥?nèi)進(jìn)行表面化學(xué)處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求。在中等pH 條件下對(duì)強(qiáng)堿性物質(zhì)具有更好的峰形。缺點(diǎn)：填料的體積隨著流動(dòng)相的不同而改變，如膨脹或收縮。分離效率相對(duì)硅膠而言比較低。重現(xiàn)性不好。常見(jiàn)的分配柱填料：碳十八柱（ODS/C18)、碳八柱（MOS/C8）、碳六柱（Hexyl/C6）、碳四柱（Butyl/C4）、碳一柱（Methyl/C1）、陰離子交換柱（SAX)、陽(yáng)離子交換柱（SCX）、苯基柱（Phenyl）、氨基柱（Amino/NH2）、氰基柱（Cyano/CN/Ni

5、trile）常見(jiàn)的吸附柱填料：硅膠柱、氰基柱、氨基柱HPLC色譜操作注意事項(xiàng)1流動(dòng)相（1）流動(dòng)相應(yīng)選用HPLC試劑、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液 需經(jīng)過(guò)濾后使用，過(guò)濾時(shí)注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范 圍；（2）流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。（3）水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換（一般不超過(guò)2天），防止長(zhǎng)菌變質(zhì)；（4）使用雙泵時(shí)，A、B、C、D四相中，若所用流動(dòng)相中有含鹽流 動(dòng)相，則A、D（進(jìn)液口位于混合器下方）放置含鹽流動(dòng)相，B、 C（進(jìn)液口位于混合器上方）放置不含鹽流動(dòng)相；（1）樣品必須經(jīng)過(guò)0.45m或0.22m的濾膜過(guò)濾，確保樣品中不含固體顆粒；（2）用流動(dòng)相或比流動(dòng)相弱（

6、若為反相柱，則極性比流動(dòng)相大；若為正相柱，則極性比流動(dòng)相?。┑娜軇┲苽錁悠啡芤?，盡量用流動(dòng) 相制備樣品液；（3）手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量盡量小，使用定量管定量時(shí)，進(jìn)樣體積應(yīng)為定量管的35倍；（4）每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑(如甲醇)等清洗進(jìn)樣器。3色譜柱（1）使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說(shuō)明書(shū)，注意適用范圍， 如pH值范圍、不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣 品；（2）連接色譜柱時(shí)，應(yīng)注意連接方向，防止反接、反沖色譜 柱；（3）使用保護(hù)柱；（4）長(zhǎng)時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注 意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如甲醇等)。（5）常規(guī)C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物

7、樣品。（6）不要高壓沖洗柱子；（7）不要在高溫下長(zhǎng)時(shí)間使用硅膠鍵合相色譜柱；使用過(guò)程中注意輕拿輕放。1注意各流動(dòng)相所剩溶液的容積設(shè)定，若設(shè)定的容積低于最低限會(huì)自動(dòng)停泵，注意洗泵溶液的體積，及時(shí)加液；2使用過(guò)程中要經(jīng)常觀察儀器工作狀態(tài)，及時(shí)正確處理各種突發(fā)事件。3堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱混合器中的過(guò)濾器管路過(guò)濾器單向閥檢查并清洗。清洗方法：以異丙醇作溶劑沖洗；用10稀硝酸清洗。4檢測(cè)器進(jìn)氣泡，用高有機(jī)溶劑沖洗5先以所用流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)一定時(shí)間（如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動(dòng)相），正式進(jìn)樣分析前30min 左右開(kāi)啟D燈或W燈，以延長(zhǎng)燈的使用壽命；6建立色譜操作方法

8、， 注意保存為自己命名的Method，勿覆蓋或刪除他人的方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果；5使用手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí)，在進(jìn)樣前和進(jìn)樣后都需用洗針液洗凈進(jìn)樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進(jìn)樣前必須用樣品液清洗進(jìn)樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡；6溶劑瓶中的沙芯過(guò)濾頭容易破碎，在更換流動(dòng)相時(shí)注意保護(hù)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)過(guò)濾頭變臟或長(zhǎng)菌時(shí)，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；6實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個(gè)管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過(guò)程中關(guān)閉D燈、W燈；7關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)閉泵、檢測(cè)器等，再關(guān)閉工作站，然后關(guān)機(jī)，最后自下而上關(guān)閉色譜儀各組件，關(guān)閉洗泵溶液的開(kāi)關(guān)；8使用者須認(rèn)真履行儀器使用

9、登記制度，出現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)向老師報(bào)告，不要擅自拆卸儀器。未經(jīng)操作培訓(xùn)，不得擅自使用儀器。氣相色譜一. 色譜法的基本原理溶于流動(dòng)相中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。二按流動(dòng)相形態(tài)分為：氣相色譜：氣固色譜、氣液色譜液相色譜超臨界流體色譜三、化學(xué)分析的目的：1.要確定被分析物是什么性質(zhì)，即給物質(zhì)定性。1）已知對(duì)照物定性 2）相對(duì)保留值定性2.要確定被分析物中每個(gè)組份的含量的大小，即給物質(zhì)定量。 以峰高或峰面積定量1）.歸一化法 2）.外標(biāo)法 3）.內(nèi)標(biāo)法 4）.內(nèi)標(biāo)對(duì)比法紫外可見(jiàn)吸收光譜統(tǒng)稱(chēng)為

10、電子光譜。紫外-可見(jiàn)吸收光譜法是利用某些物質(zhì)的分子吸收200800nm光譜區(qū)的輻射來(lái)進(jìn)行分析測(cè)定的方法。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價(jià)電子和分子軌道上的電子在電子能級(jí)間的躍遷，廣泛用于有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)的定性和定量測(cè)定。紫外可見(jiàn)吸收光譜的特點(diǎn)（1）紫外可見(jiàn)吸收光譜所對(duì)應(yīng)的電磁波長(zhǎng)較短，能量大，它反映了分子中價(jià)電子能級(jí)躍遷情況。主要應(yīng)用于共軛體系（共軛烯烴和不飽和羰基化合物）及芳香族化合物的分析。（2）由于電子能級(jí)改變的同時(shí)，往往伴隨有振動(dòng)能級(jí)的躍遷，所以電子光譜圖比較簡(jiǎn)單，但峰形較寬。一般來(lái)說(shuō)，利用紫外可見(jiàn)吸收光譜進(jìn)行定性分析信號(hào)較少。（3）紫外可見(jiàn)吸收光譜常用于共軛體系的定量分析，靈敏度高，檢出限低。1、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)由光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器以及數(shù)據(jù)處理及記錄（計(jì)算機(jī)）等部分組成。1、基本原理：不同的有機(jī)化合物具有不同的紫外可見(jiàn)吸收光譜，可進(jìn)行簡(jiǎn)單的定性分析；同一化合物在不同濃度下的吸光度在一定條件下符合朗伯-比爾定律：所以我們可以利用有機(jī)物的紫外可見(jiàn)光譜進(jìn)行定性分析和定量分析利用傅立葉紅外技術(shù)檢測(cè)的工作原理光源發(fā)出的紅外光經(jīng)干涉儀轉(zhuǎn)變成干涉光，通過(guò)試樣后得到含試樣信息的干涉圖，由電子計(jì)算機(jī)采集，并經(jīng)過(guò)快速傅立葉變換，得到吸收強(qiáng)度或透光度隨頻率或波數(shù)變化的紅外光譜圖。 利用傅立葉紅外技