氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

1、氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)本試劑盒是適用于各種農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中的低含量氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯檢測(cè)。1、原理利用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附原理，將菊酯類農(nóng)藥半抗原-蛋白（固定抗原）偶聯(lián)物包被于聚苯乙烯微量反應(yīng)板的孔穴中，再加入樣品提取液（含游離抗原）和抗體，使固定和游離抗原與抗體進(jìn)行免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，使在酶標(biāo)板上形成抗原-抗體-羊抗兔IgG -酶復(fù)合物，然后加酶底物顯色。顏色的深淺與游離抗原的量成反比。即游離抗原的量越大，顏色越淺；游離抗原的量越小，顏色越深。用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的光吸收值，與菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品作比較來(lái)判斷樣品中菊酯類農(nóng)藥的含量。2、試劑盒組成2.

2、1 包被抗原：菊酯類農(nóng)藥半抗原與卵清蛋白OVA的偶聯(lián)物，50ul/瓶，使用時(shí)用包被緩沖液稀釋3000倍。2.2 檢測(cè)抗體：新西蘭大白兔經(jīng)免疫后取血清制備，100ul/瓶，使用時(shí)用PBS緩沖液稀釋6000倍和樣品預(yù)混。2.3 底物: 四甲基聯(lián)苯胺（TMB），5mg/瓶。 2.4 HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG：工作濃度1：10000，用PH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋使用。的過(guò)氧化氫。100ul/瓶2.6 96孔酶標(biāo)板。2.7 卵清蛋白（OVA），0.5g/瓶。以上試劑每套試劑盒各配備一瓶。3、需自行準(zhǔn)備的試劑氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯標(biāo)樣4、分析步驟氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯標(biāo)樣配制：將氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯標(biāo)

3、準(zhǔn)品用丙酮配制成10m，g/mL儲(chǔ)備液，使用時(shí)分別用含有10丙酮的PH7.4的PBS緩沖液稀釋成5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。4.1 將包被抗原用包被緩沖液稀釋到1ug/ml，包被酶標(biāo)板，每孔100L，4過(guò)夜。4.2 酶標(biāo)板用洗液洗滌3次，并在每孔中加入200L1OVA封閉液，37溫育1小時(shí)。4.3 酶標(biāo)板用洗液洗滌3次，加入不同濃度的氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)樣品（制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）或樣品提取液（檢測(cè)樣品中的氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯含量）與抗體溶液的混合液（1：1，每孔100L，該混合液應(yīng)于使用前一天配好，4過(guò)夜備用）， 37溫育 2小時(shí)。4.4 酶標(biāo)板洗

4、滌同上。加入酶聯(lián)葡萄球菌A蛋白，每孔100L，37溫育1小時(shí)。4.5酶標(biāo)板洗滌同上?？焖偌尤氲孜锶芤海靠?00L，37 溫育15分鐘。4.6 快速加入2M的硫酸溶液，終止反應(yīng)，每孔50L，于450nm處測(cè)定吸光值。5、結(jié)果計(jì)算設(shè)定對(duì)照孔F11、G11、H11孔的OD值的平均值為Bo，1至6列的A、B、C孔的OD值平均值為B(n=l，2，3，4，5，6)，同一樣品的重復(fù)孔的OD值平均值為Byp(yp代表不同的樣品)。每組數(shù)據(jù)都以三次重復(fù)的平均值為準(zhǔn)。以氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯標(biāo)樣濃度的常用對(duì)數(shù)logc為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)應(yīng)的抑制率I=100(BoByp)Bo為縱坐標(biāo)(Y)，可得一條Y=a+bX直線

5、。將Byp經(jīng)換算成Yyp，然后代入直線中，可得Xyp，對(duì)Xyp取反對(duì)數(shù)，即可得知樣品中氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯含量Cyp。本方法的重復(fù)測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差不得超過(guò)10%。6、 保存本試劑盒中包被抗原和檢測(cè)抗體需在20下保存，其他試劑保存在4，保質(zhì)期為4-6個(gè)月。 附注1、配套試劑要求和配制1.1稱取1.59碳酸鈉（Na2CO3），2.93g碳酸氫鈉（NaHCO3），加水稀釋至1000mL。1.2 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）氯化鈉（NaCl）8.0g，氯化鉀（KCl）0.2g，磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）2.9g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，加去離子水定容至1L。1.3洗液：

6、含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。1.4封閉液：1%的OVA溶液。1gOVA溶于100mL磷酸鹽緩沖液中。1.5底物緩沖液: PH5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液，配制方法如下：檸檬酸（C6H7O8）21g，磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）71.6g，加去離子水定容至1L 1.6 底物溶液：取100LTMB（10mgTMB溶于1mL二甲基甲酰胺中）溶液+9.875mL底物緩沖液+ 25L0.65%過(guò)氧化氫，混勻。1.7 終止液: 2mol/L的H2SO4。濃硫酸溶解在500ml雙蒸水中。附注2、所需儀器設(shè)備及要求2.1微量連續(xù)可調(diào)取樣器及吸頭：1-5，5-50，200-1000L2.2電熱恒溫水浴鍋2.3酶標(biāo)測(cè)定儀：含波長(zhǎng)450nm的濾光片分析天平：感量0.0001g附注3、樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照孔和空白孔在酶標(biāo)板上的分布示意123456789101112A空白標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1空白樣品1樣品3B標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1對(duì)照樣品1樣品3C標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1標(biāo)樣1對(duì)照樣品1樣品3D標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2對(duì)照樣品2樣品4E標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2對(duì)照樣品2樣品4F空白標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2標(biāo)樣2對(duì)照樣品2樣品4GHABC三列17排加氯氰菊酯系列濃度的標(biāo)樣DEF三列17排加三氟氯