三七總皂甙對嗎啡戒斷大鼠海馬磷酸化CREB蛋白表達(dá)及CREBDNA結(jié)合活性的影響

1、三七總皂甙對嗎啡戒斷大鼠海馬磷酸化CREB蛋白表達(dá)及CREB/DNA結(jié)合活性的影響            作者：閆玉仙，呼文亮，叢斌，牛增強(qiáng)，李淑瑾，余磊，馬春玲，張國忠，左敏 【關(guān)鍵詞】  嗎啡依賴    Effects of Panax Notoginseng on phosphorylated CREB protein expression and CREB/DNA binding activity in hippocampus of mo

2、rphine withdrawal rats【Abstract】 AIM: To investigate the effects of Panax Notoginseng (PNS) on the expressions of CREB, phosphorylated CREB (pCREB) and CREB/DNA binding activity in hippocampus of the morphine dependent rats and the naloxoneprecipitated withdrawal syndrome rats, and to explore the me

3、chanism by which PNS inhibits the  morphine withdrawal symptom in rats. METHODS: The models of morphine physical dependent rats and withdrawal syndrome were established by subcutaneous injection of morphine in gradually increasing doses and abdominal cavity injection of naloxone respectively. T

4、he rats were treated with PNS by intragastric administration at various doses simultaneously when administrated with morphine. The effects of morphine on the expressions of CREB, pCREB, CREB/DNA binding activity in hippocampus were detected by Western blot and electrophoresis mobility shift assay (E

5、MSA). RESULTS: The CREB protein expression in hippocampus was not significantly statistically different in morphine physical dependent group (MOR), naloxone precipitated withdrawal group (NAL) and PNS groups compared with control group (P>0.05); The pCREB protein expression and CREB/DNA binding a

6、ctivity in hippocampus were not significantly increased in MOR compared with control group and were significantly increased in NAL compared with MOR and control groups; PNS could dosedependently downregulate the increased expression of pCREB and CREB/DNA binding activity in hippocampus induced by na

7、loxoneprecipitated withdrawal. CONCLUSION: PNS could inhibit the expression of pCREB and CREB/DNA binding activity in hippocampus in a dosedependent manner.【Keywords】 Panax Notoginseng; morphine dependence; naloxone; substance withdrawal syndrome; pCREB【摘要】 目的: 研究三七總皂甙（PNS）對嗎啡依賴及納絡(luò)酮催促戒斷大鼠海馬組織CREB，pC

8、REB蛋白表達(dá)及CREB/DNA結(jié)合活性的影響，探討PNS抑制嗎啡戒斷癥狀的作用機(jī)制. 方法：應(yīng)用劑量遞增法皮下注射鹽酸嗎啡建立嗎啡軀體依賴模型，采用腹腔注射納絡(luò)酮建立催促戒斷模型，大鼠在給予嗎啡的同時，采用4種不同劑量PNS進(jìn)行灌胃. 采用Western blot和電泳遷移率改變分析法(EMSA)分別觀察PNS對嗎啡依賴及戒斷大鼠海馬組織總CREB，pCREB蛋白表達(dá)及CREB/DNA結(jié)合活性的影響. 結(jié)果：不同劑量PNS組、嗎啡成癮（MOR）組及納絡(luò)酮催促戒斷(NAL)組大鼠海馬組織總CREB蛋白表達(dá)與對照組相比無顯著性差異（P>0.05）；MOR組pCREB蛋白表達(dá)及CREB/DN

9、A結(jié)合活性數(shù)值略高于對照組（P>0.05），NAL組pCREB蛋白表達(dá)及CREB/DNA結(jié)合活性數(shù)值明顯高于對照組和MOR組（P<0.01）；PNS可以劑量依賴性的抑制納絡(luò)酮催促戒斷所引起的pCREB蛋白表達(dá)增高和CREB/DNA結(jié)合活性的增強(qiáng). 結(jié)論：PNS可以劑量依賴的抑制嗎啡成癮及納絡(luò)酮催促戒斷誘導(dǎo)的大鼠海馬組織CREB磷酸化和CREB/DNA結(jié)合活性的增強(qiáng).【關(guān)鍵詞】 三七總皂甙；嗎啡依賴；納絡(luò)酮;物質(zhì)戒斷綜合癥；磷酸化CREB0引言三七(Panax notoginseng (Burk)F1H1Chen)為五加科植物，現(xiàn)已從不同部位分離得到數(shù)十種單體皂甙成份，其中三七總皂苷

10、（Panax Notoginseng，PNS）是三七的主要生物活性成份，具有活血化淤、抗氧化、抑制細(xì)胞內(nèi)Ca超載、改善學(xué)習(xí)記憶、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、增加免疫功能等功效，是一種非特異性鈣拮抗劑. 關(guān)于PNS對嗎啡成癮大鼠戒斷綜合癥的研究國內(nèi)外至今尚未見報道. 我們研究了PNS對嗎啡依賴及戒斷大鼠核轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化以及DNA結(jié)合活性的影響，探討PNS在戒毒方面的應(yīng)用及機(jī)理. 1材料和方法1.1材料健康雄性SD大鼠42只，體質(zhì)量200220 g，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供，合格證號19020；鹽酸嗎啡(morphine hydrochloride，MOR)，沈陽第一制藥廠生產(chǎn)，批號：遼寧

11、藥準(zhǔn)字(1996)第002747號. 鹽酸納絡(luò)酮、氨基甲酸乙酯、亮肽素(leupeptin)(美國Sigma公司)；CREB及pCREB抗體(美國Santa Cruz公司). PNS(天津天士力聯(lián)合制藥股份有限公司提供)，EMSA試劑盒(美國Promega)，32PATP(北京福瑞生物公司)，Multiphor多功能電泳系統(tǒng). 凝膠成像分析儀（美國UVP公司）.1.2方法1.2.1動物模型的制作及分組模型鼠隨機(jī)分為對照組（Control），嗎啡依賴組（MOR），納絡(luò)酮催促戒斷組（NAL）和PNS50，PNS100，PNS200，PNS400組（PNS50，100，200，400 mg/kg治療

12、組），每組6只. MOR組、NAL組和PNS組參照文獻(xiàn)記載以劑量遞增法連續(xù)5 d背部皮下給予（sc）嗎啡的方法建立嗎啡依賴大鼠模型. 首日嗎啡20 mg/kg，分2次(sc)(8:00，18:00). 以后每日增加20 mg/kg，第5日嗎啡每次用量達(dá)50 mg/kg. 第6日上午8:00末次注射嗎啡50 mg/kg. NAL組和PNS組在末次注射嗎啡2 h后皮下注射納絡(luò)酮5 mg/kg. PNS50，PNS100，PNS200，PNS400組在給予嗎啡的同時分別按50，100，200，400 mg/kg劑量進(jìn)行灌胃. 對照組在相同時間注射生理鹽水.1.2.2Western blot檢測CRE

13、B及pCREB蛋白表達(dá)每組大鼠取6只, 麻醉后在冰臺上取出大腦，冰浴下分離海馬，依照文獻(xiàn)1加入預(yù)冷提取緩沖液進(jìn)行勻漿. 4離心(12 000 g，5 min)，取上清，置70低溫冰箱中保存，供測定總CREB和pCREB水平. 用考馬斯亮蘭G250試劑盒測定每一組樣品蛋白濃度.    各組取蛋白200 g，電泳分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜. 將膜置于50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，分別加兔抗大鼠非磷酸化的CREB1和羊抗大鼠pCREB抗體，4孵育過夜，TBS洗膜后，分別加入HRP標(biāo)記的IgG二抗，37孵育1 h，TBS洗膜后采用化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果，以actin

14、作為內(nèi)參對照. 上述實驗重復(fù)3次. 用ScionImage軟件對結(jié)果進(jìn)行半定量分析，用AU（DareaDdensity）代表條帶的面積×光密度值，以CREB/actin和pCREB/actin的AU比值代表的CREB和pCREB相對含量.1.2.3EMSA檢測CREB/DNA結(jié)合活性方法同上分離海馬，提取組織核蛋白,測定CREB/DNA結(jié)合活性. 用考馬斯亮蘭G250試劑盒測定每一組樣品蛋白濃度. 含有CREB特異性識別位點的雙鏈脫氧寡核苷酸為：5AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG3和5CTAGCTCTCTGACGTCAGGCAATCTCT3，用T4多核苷酸激酶進(jìn)

15、行末端標(biāo)記32PATP，乙醇沉淀法純化標(biāo)記的寡核苷酸. 取50 g核蛋白與同位素標(biāo)記的DNA探針(3.5 pmol, 10 Ci)在室溫下進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)30 min，反應(yīng)成份包括：1 mmol/L MgCl2, 0.5 mmol/L EDTA, 0.5 mmol/L DTT, 50 mmol/L NaCl, 10 mmol/L TrisHCl (pH 7.5), 0.05 g poly(dIdC)和40 g/L甘油，總體積為9 L. 60 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠置真空干膠儀上真空干燥，70放射自顯影48 h. 上述實驗重復(fù)3次. 結(jié)果用凝膠圖像分析管理系統(tǒng)對電泳譜帶進(jìn)行半定量分析，取其面

16、積與光密度值的乘積代表CREB的相對活性.百事通 統(tǒng)計學(xué)處理： 用ScionImage軟件和凝膠成像分析儀分別對Western和EMSA結(jié)果進(jìn)行半定量分析. 用AU(DareaDdensity)代表條帶的面積乘光密度值，表示目的蛋白的相對含量. 多組實驗結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析. 數(shù)據(jù)用x±s表示，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差異法(least significant difference, LSD)作兩兩比較，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異.2結(jié)果2.1PNS對嗎啡戒斷大鼠海馬組織總CREB的影響實驗結(jié)果表明：大鼠在慢性給予嗎啡處理、納絡(luò)

17、酮催促戒斷及給予不同劑量PNS后海馬組織總CREB的表達(dá)在各組之間有所不同，但與對照組相比均無顯著性差異（P>0.05，表1，圖1A）.2.2PNS對嗎啡戒斷大鼠海馬組織磷酸化CREB蛋白表達(dá)的影響慢性MOR組海馬組織pCREB蛋白表達(dá)較對照組略有升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）. NAL組海馬組織pCREB蛋白表達(dá)顯著高于對照組和MOR組(P<0.01)，在給予嗎啡的同時每kg體質(zhì)量分別給予50，100，200，400 mg PNS之后可以顯著降低海馬組織的pCREB蛋白表達(dá)，并呈劑量依賴性，以400 mg/kg劑量組磷酸化水平降低最為顯著（P<0.01，圖1B，

18、表1）.表1PNS對嗎啡戒斷大鼠海馬CREB、pCREB表達(dá)以及CREB/DNA結(jié)合活性的影響(略)aP<0.05, bP<0.01 vs對照組； fP<0.01 vs MOR； dP<0.01 vs NAL.對照：鹽水處理組；MOR：單獨(dú)給予嗎啡處理組；NAL：納洛酮催促戒斷組；PNS50：PNS50 mg/kg治療組；PNS100：PNS100 mg/kg治療組；PNS200：PNS200 mg/kg治療組；PNS400：PNS400 mg/kg治療組；CREB：cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白；pCREB：磷酸化CREB.1：鹽水處理組；2：單獨(dú)嗎啡處理組；3：納洛酮催促

19、戒斷組；4：PNS 50 mg/kg治療組；5：PNS 100 mg/kg治療組；6：PNS 200 mg/kg治療組；7：PNS 400 mg/kg治療組.圖1Western blot檢測PNS對嗎啡戒斷大鼠海馬組織總CREBp(A)和CREB(B)的影響(略)2.3PNS對嗎啡戒斷大鼠海馬組織CREB/DNA結(jié)合活性的影響實驗結(jié)果顯示：嗎啡依賴大鼠海馬組織CREB/DNA結(jié)合活性與對照組相比無顯著差異(P>0.05). 納絡(luò)酮催促戒斷則使大鼠海馬CREB/DNA結(jié)合活性顯著高于對照組和MOR組(P<0.01，表1).3討論    慢性嗎啡引起神經(jīng)元

20、可塑性和適應(yīng)性改變的基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)某些靶蛋白表達(dá)，機(jī)體穩(wěn)態(tài)重建的結(jié)果2. 轉(zhuǎn)錄因子CREB是腦內(nèi)介導(dǎo)多個信號通路調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的主要核因子，其在腦組織內(nèi)含量豐富，尤以神經(jīng)元內(nèi)居多3. CREB是首先發(fā)現(xiàn)的與藥物成癮密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)和功能是目前醫(yī)學(xué)界研究的熱點之一4.慢性嗎啡誘導(dǎo)的依賴、納絡(luò)酮誘導(dǎo)的戒斷動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)以及某些細(xì)胞株的CREB磷酸化程度明顯升高以及CREB/CRE結(jié)合活性增強(qiáng)，且其變化具有區(qū)域特異性，是衡量神經(jīng)細(xì)胞活動程度的重要生化指標(biāo)5-6. 而海馬作為邊緣結(jié)構(gòu)則廣泛地參與了學(xué)習(xí)與記憶過程，是參與成癮記憶形成和強(qiáng)化的重要腦區(qū)7-8，因此本實驗選取海馬作為實驗?zāi)X區(qū)

21、. 結(jié)果證實，慢性給予嗎啡、納絡(luò)酮催促戒斷及不同劑量PNS各組CREB蛋白表達(dá)水平在海馬組織有所不同，但與對照組相比均無顯著性差異（P>0.05），嗎啡依賴大鼠海馬組織中CREB磷酸化水平及CREB/DNA結(jié)合活性有增高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，而納絡(luò)酮催促戒斷大鼠海馬組織中CREB磷酸化水平及CREB/DNA結(jié)合活性則明顯的高于對照組和嗎啡依賴組大鼠.我們研究從蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平研究了PNS對嗎啡依賴大鼠納絡(luò)酮催促戒斷誘導(dǎo)的腦內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CREB的影響，探討了三七總皂甙緩解嗎啡戒斷癥狀的部分分子機(jī)制，研究結(jié)果為PNS的臨床應(yīng)用提供了必要理論依據(jù).【參考文獻(xiàn)】1 董明, 熊纓, 徐侃彥. 記憶

22、增強(qiáng)肽促進(jìn)大鼠海馬內(nèi)CREB磷酸化J. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報, 2000,32(6):575-580.2 Nestler EJ. Molecular basis of longterm plasticity underlying addictionJ. Nat Rev Neurosci, 2001,2(2): 119-128.3 Noda Y, Nabeshima T. Learning/memory and drug dependenceJ. Nippon Yakurigaku Zasshi, 2002,119(4): 213-217.4 Carrie L Walters， Julie A Blendy. Different requirements for cAMP response element binding protein in positive and negative reinforcing properties of drugs of AbuseJ. Neuroscience, 2001,21(23): 9438-9444.5 Ahmed BY, Yamaguchi F, Tsumura T, et al. E