響應(yīng)面法優(yōu)化水溶性米糠酶提取物的制備及其體外抗氧化活性研究

1、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)SIPT計(jì)劃大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目申請(qǐng)書院 系 名 稱 理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系 項(xiàng) 目 名 稱 響應(yīng)面法優(yōu)化水溶性米糠酶提取物（AEERB）的制備及其體外抗氧化活性研究_研 究 周 期 一年 計(jì)劃項(xiàng)目負(fù)責(zé)人 張寶林 所在年級(jí)、專業(yè) 應(yīng)化1201班 聯(lián) 系 電 話電 子 郵 件 389134244 指 導(dǎo) 教 師 王宇昕 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校團(tuán)委制填寫說明及注意事項(xiàng) 一、申報(bào)書須逐項(xiàng)認(rèn)真填寫，填寫內(nèi)容必須實(shí)事求是，表達(dá)明確嚴(yán)謹(jǐn)?？杖表?xiàng)要填“無”。二、表格中的字體小四號(hào)仿宋體，1.5倍行距；需簽字部分由相關(guān)人員以黑色鋼筆或水筆簽名。均用A4 紙打印，于左側(cè)裝訂成冊(cè)。三、參與大

2、學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目的學(xué)生不超過4人，項(xiàng)目執(zhí)行時(shí)間為1-2年。四、校內(nèi)指導(dǎo)老師應(yīng)具有中級(jí)職稱以上（含），每個(gè)指導(dǎo)老師指導(dǎo)的項(xiàng)目數(shù)原則上不超過1項(xiàng)。五、計(jì)劃項(xiàng)目必須先由學(xué)校導(dǎo)師及企業(yè)導(dǎo)師提出意見、由所在院（系）審核后再推薦上報(bào)。推薦上報(bào)的計(jì)劃項(xiàng)目表一式三份（均為原件）報(bào)送校團(tuán)委，同時(shí)提交電子文檔。項(xiàng)目名稱響應(yīng)面法優(yōu)化水溶性米糠酶提取物（AEERB）的制備及其體外抗氧化活性研究項(xiàng)目周期一年項(xiàng)目負(fù)責(zé)人張寶林學(xué)號(hào)A20120152班級(jí)應(yīng)化1201班入學(xué)年份2012電-mail389134244項(xiàng)目組其他成員學(xué)生姓名性別院（系）名稱專業(yè)班級(jí)年級(jí)聯(lián)系電話郎賓宇男理學(xué)院應(yīng)化120212

3子赫女理學(xué)院應(yīng)化12021218646086710韓鈺女理學(xué)院應(yīng)化13011315545115206指導(dǎo)教師姓名王宇昕性別女研究方向食品科學(xué)職稱講師手目來源（在相應(yīng)位置打）學(xué)生自擬項(xiàng)目（ ）、導(dǎo)師提供項(xiàng)目（ ）一、項(xiàng)目研究背景（500字以內(nèi)）米糠是糙米在碾磨加工過程中的主要副產(chǎn)物，包括果皮、種皮、珠心層、糊粉層、胚芽、粉質(zhì)胚乳的外層部分。米糠是功能性蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、粗纖維、B族維生素、礦物質(zhì)的良好來源，含有-谷維素、生育酚、生育三烯酚、黃酮、多酚等天然抗氧化成分，無膽固醇。因而，米糠可被用于研究開發(fā)保健食品、提取多種天然生物活性物質(zhì)，

4、堪稱“天賜營(yíng)養(yǎng)源”。盡管米糠天然抗氧成分和營(yíng)養(yǎng)蛋白含量豐富，但是由于其蛋白的高度不溶解性，營(yíng)養(yǎng)品成分不全面，易于酸敗和難于貯存很大程度上限制了其作為功能性食品或保健品的應(yīng)用和開發(fā)。因此，有必要開發(fā)一種具有良好的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)的米糠提取物來解決這些問題。通過對(duì)全脂米糠進(jìn)行酶法修飾，由于蛋白質(zhì)與脂類物質(zhì)的相互作用，溶液的乳化性增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)米糠中親水、親脂兩大類物質(zhì)的同時(shí)溶出提取。水酶法制得的水溶性米糠酶提取物（AEERB）不但能夠最大程度增強(qiáng)生物功能全成分利用全脂米糠，更利于人體的消化、吸收和利用；還使得米糠中的內(nèi)源性脂肪酶遭到破壞，增強(qiáng)了產(chǎn)物的穩(wěn)定性。因此，AEERB是一種對(duì)全脂米糠全新的

5、利用方式，推動(dòng)了米糠新產(chǎn)品在功能食品領(lǐng)域的開發(fā)與利用。二、項(xiàng)目立論依據(jù)1項(xiàng)目研究目的和意義（500字以內(nèi)）近年來隨著人們生活水平不斷提高，冠心病、高血壓、高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化等一系列心血管疾病發(fā)病率逐漸升高。氧化損傷是造成心腦血管疾病多發(fā)的主要因素。流行病學(xué)研究顯示，日常生活中人們攝入谷物和豆類食物能夠提高機(jī)體的抗氧化水平，改善心血管功能。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于植物源功能性營(yíng)養(yǎng)特性的研究都集中大豆蛋白和大米蛋白等，缺乏其他植物源活性物質(zhì)的系統(tǒng)研究。在已有的關(guān)于米糠系列產(chǎn)物抗氧化的研究中，往往多集中于米糠醇提取物上，且把功能評(píng)價(jià)和成分分析割裂開來，即使是對(duì)水溶性米糠酶提取物的研究也缺乏米糠水酶提取物中

6、親水、親脂組分與抗氧化活性關(guān)系的研究。本項(xiàng)目以AEERB為研究對(duì)象，其同時(shí)含有親水和親脂成分，功能活性成分種類多且具有較好的抗氧化生物活性。通過本項(xiàng)目的研究可以得到AEERB最佳制備工藝，并明確不同溶劑組分對(duì)其抗氧化活性的貢獻(xiàn)。此外，制備新型AEERB還可以促進(jìn)米糠新產(chǎn)品在功能食品領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用，為米糠的精深加工及高值化利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，進(jìn)一步帶動(dòng)高附加值特色米糠產(chǎn)品開發(fā)，促進(jìn)特色農(nóng)產(chǎn)品走向國(guó)際市場(chǎng)都具有十分重要的意義。2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀（500字以內(nèi)）近年來，美國(guó)、尤其日本等經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家的糧油加工企業(yè)，利用高新技術(shù)對(duì)米糠深度加工和綜合利用已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，產(chǎn)品包括米糠油、米糠健康食

7、品、日化、醫(yī)藥等，附加值劇增數(shù)十倍。相比之下，我國(guó)對(duì)米糠的深度開發(fā)利用及相應(yīng)的理論研究和高科技產(chǎn)品的開發(fā)尚處于較低水平，目前大部分用于飼料，只有不足10%左右的米糠用來制油或提取植酸鈣、肌醇、谷維素等價(jià)值高的產(chǎn)品。目前關(guān)于米糠的相關(guān)研究可以大致分為兩大方面，一方面是對(duì)親脂組分的開發(fā)利用，首先就是米糠油的提取，其次為一些植物化學(xué)物質(zhì)（-谷維素、生育酚、生育三烯酚）的制備與生物活性測(cè)定；另一方面是對(duì)親水組分的研究，主要是以提完油后的脫脂米糠為原料，通過不同的方法提取純化蛋白質(zhì)，以提高蛋白質(zhì)乳化性、溶解性等功能特性，并進(jìn)一步研究米糠抗氧化肽等。有關(guān)米糠可溶性酶解物的制備與抗氧化活性研究，尤其是關(guān)于米

8、糠水酶提取物中親水、親脂組分與抗氧化活性關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。而且在以米糠為研究對(duì)象時(shí)，通常將親水、親脂兩大類組分分開來研究，極少將其共同加以利用。此外，對(duì)米糠水酶提取物中各組分和抗氧化活性之間的關(guān)系研究沒有相關(guān)報(bào)道。三、項(xiàng)目實(shí)施方案（2500字以內(nèi)）1項(xiàng)目研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)1） 響應(yīng)面法優(yōu)化AEERB的制備工藝2） 按極性大小對(duì)AEERB進(jìn)行分部3） 比較各部分抗氧化活性研究?jī)?nèi)容1） 響應(yīng)面法優(yōu)化AEERB的制備工藝：以時(shí)間、溫度、固液比、酶底比（E/S）以及pH為獨(dú)立變量，以-谷維素含量和總還原能力（FRAP）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)

9、計(jì)，優(yōu)化AEERB的制備工藝。2） 按極性大小對(duì)AEERB進(jìn)行分部: 依次用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)AEERB進(jìn)行萃取，浸提并濃縮。分為正己烷部，氯仿部，乙酸乙酯部，正丁醇部和水部五部分。3） 比較各部分抗氧化活性：以上五種極性組分分別進(jìn)行多種抗氧化實(shí)驗(yàn)，通過不同極性和不同反應(yīng)機(jī)理的抗氧化實(shí)驗(yàn)研究各組分和其抗氧化的活性關(guān)系。擬解決的關(guān)鍵問題1） 確定AEERB制備工藝2） 確定AEERB抗氧化的主活性部分2項(xiàng)目的研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析研究方法1） 響應(yīng)面法優(yōu)化AEERB的制備工藝：以時(shí)間、溫度、固液比（S/L）、酶底比（E/S）以及pH為獨(dú)立變量，以-谷維素含量和FR

10、AP為響應(yīng)值，優(yōu)化制備工藝。2） 抗氧化活性測(cè)定方法：總抗氧化能力、FRAP、清除超氧陰離子自由基的測(cè)定、清除羥自由基的測(cè)定、清除DPPH自由基能力、 ABTS自由基清除率，總還原力，亞油酸過氧化抑制率。技術(shù)路線：實(shí)驗(yàn)方案1） AEERB制備工藝的優(yōu)化：在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，五因素三水平，共計(jì)46個(gè)實(shí)驗(yàn)，得到AEERB的最佳制備工藝。其中，-谷維素含量采用紫外分光光度法測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)314±1nm；FRAP測(cè)定方法見下3）-b部分內(nèi)容。2） AEERB的極性分部：取原料AEERB適量，依次加入萃取溶劑，萃取三次，合并溶液進(jìn)行減壓濃縮。3）

11、 AEERB各極性部分抗氧化活性測(cè)定：a總抗氧化能力（磷鉬絡(luò)合法）：經(jīng)過強(qiáng)氧化劑的作用，Mo離子以高價(jià)態(tài)存在，加入抗氧化劑后，Mo離子被還原呈現(xiàn)綠色，溶液顏色越深，抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)。b鐵還原力測(cè)定（FRAP）：體系中的Fe3+-TPTZ被抗氧化劑還原成Fe2+-TPTZ后顏色變成深紫色，可以通過各組分A593比較其抗氧化活性的高低。c清除超氧陰離子自由基的測(cè)定（鄰苯三酚法）：鄰苯三酚在堿性條件下自氧化，釋放出超氧陰離子自由基，中間產(chǎn)物在325nm有強(qiáng)吸收，當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，可清除超氧陰離子自由基，阻止中間產(chǎn)物累積，該波長(zhǎng)下吸收減弱，可以通過測(cè)定A325在加入抗氧化前后的變化來判定抗氧化

12、效果。d清除羥自由基的測(cè)定（芬頓法）：H2O2在Fe2+的催化作用下，分解產(chǎn)生羥基自由基，加入鄰菲啰啉，和Fe2+反應(yīng)生成穩(wěn)定橙紅色物質(zhì)，當(dāng)向該體系中加入抗氧化活性物質(zhì)時(shí)，會(huì)阻止羥自由基的生成，從而改變絡(luò)合物顏色的深淺。e清除DPPH自由基能力：DPPH自由基乙醇溶液呈深紫色，在517 nm處可檢測(cè)到吸收峰，當(dāng)有抗氧化活性物質(zhì)時(shí)，自由基所帶的孤對(duì)電子消失，溶液顏色變淺。通過比較前后DPPH溶液顏色的變化即可。f清除 ABTS自由基：ABTS在適當(dāng)氧化劑作用下能夠產(chǎn)生藍(lán)色或者綠色的ABTS·+自由基，抗氧化劑所誘導(dǎo)的清除自由基的反應(yīng)過程中又將ABTS·+自由基還原成ABTS，

13、降低了溶液在734 nm處的紫外吸收，吸光度降低的程度取決于反應(yīng)持續(xù)的時(shí)間以及樣品本身的抗氧化能力與濃度。g總還原力：采用SDS-改進(jìn)的鐵氰化物法檢測(cè)樣品的還原能力。在抗氧化劑存在下，三價(jià)鐵離子被還原成二價(jià)，鐵氰化鉀與二價(jià)鐵離子反應(yīng)生成一種藍(lán)色沉淀。添加SDS溶液，形成的藍(lán)色溶液更穩(wěn)定。h亞油酸過氧化抑制率：借助亞油酸體系，利用硫氰酸鐵法測(cè)定樣品抗脂質(zhì)氧化的能力。在亞油酸發(fā)生氧化的過程中，過氧化物形成的同時(shí)將二價(jià)鐵離子氧化成三價(jià)鐵離子，后者與硫氰酸根（SCN-）形成紅色的絡(luò)合物，該物質(zhì)在500 nm處存在吸收峰，當(dāng)向乳化體系中加入抗氧化劑時(shí)，抑制亞油酸發(fā)生氧化，三價(jià)鐵離子濃度降低，紅色絡(luò)合物的

14、吸光值有所下降，綜上利用比色法可以表示出樣品的抗氧化水平?？尚行苑治龀醪秸莆樟薃EERB的制備方法，確定了其主要活性成分，有資料也表明谷維素，生育酚，多酚和黃酮類化合物都具有抗氧化的功效。這些保證了項(xiàng)目的順利開展。此外，項(xiàng)目組所在實(shí)驗(yàn)中心擁有氣相色譜儀、高壓液相色譜儀、傅立葉紅外光譜儀、熒光分光光度計(jì)、紫外分光光度計(jì)、凍干機(jī)、高速冷凍離心機(jī)等、平板式超濾層析、電泳等大型設(shè)備。應(yīng)化系已有的研究平臺(tái)為本研究的順利進(jìn)行提供了保障。3本項(xiàng)目的創(chuàng)新之處1）響應(yīng)面法優(yōu)化水溶性米糠酶提取物的制備工藝未見報(bào)道。2）水溶性米糠酶提取物各個(gè)極性組分的抗氧化活性差異未見報(bào)道。4項(xiàng)目研究的預(yù)期成果1）確定AEERB的

15、最佳制備工藝2）通過極性分部和各部分抗氧化的測(cè)定，確定AEERB的主活性部分。3）發(fā)表論文1篇。四、項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)預(yù)算1科研業(yè)務(wù)費(fèi)   700元 1) 測(cè)試和分析費(fèi)：AEERB制備、抗氧化指標(biāo)測(cè)定。預(yù)算經(jīng)費(fèi)：500元。2) 論文發(fā)表等：論文版面費(fèi)，資料查詢復(fù)印，年度總結(jié)。預(yù)算經(jīng)費(fèi)：200元。 2實(shí)驗(yàn)材料費(fèi) 300元 原材料/試劑/藥品購(gòu)置費(fèi)：原材料和試劑300元。五、指導(dǎo)教師意見（600字以內(nèi)）項(xiàng)目研究的選題意義、項(xiàng)目研究方案的科學(xué)性、可行性21世紀(jì)食品消費(fèi)的一大趨勢(shì)體現(xiàn)在由天然原材料制成的產(chǎn)品受到廣泛歡迎。米

16、糠中營(yíng)養(yǎng)成分種類多、功能性因子達(dá)數(shù)十種，其深加工產(chǎn)品被證明具有多種生理功效，如預(yù)防腫瘤、提高免疫力、降血脂血糖、抗疲勞等，因此米糠在功能保健食品領(lǐng)域存在廣闊的發(fā)展空間和潛在的應(yīng)用價(jià)值?？寡趸悄壳肮δ苄允称返难芯繜狳c(diǎn)?？蒲泄ぷ髡咭仓铝τ陂_發(fā)和利用天然的抗氧化劑來替代合成的抗氧化劑。酶解條件溫和，蛋白和脂肪的相互作用的同時(shí)，鈍化了脂肪酶活性，提高了浸提液中的脂溶性（谷維素，生育酚，生育三烯酚和不飽和脂肪酸）和水溶性（蛋白，多酚和黃酮）成分的共同溶出，實(shí)現(xiàn)了米糠全成分的綜合利用。該研究技術(shù)路線設(shè)計(jì)合理，研究方案科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。通過響應(yīng)面法確定最佳工藝，并可以明晰酶解過程中各獨(dú)立變量對(duì)響應(yīng)值的影響作用順序，為米糠的精深加工及高值化利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。萃取劑間極性差異較大，可以實(shí)現(xiàn)充分的分級(jí)萃取分離，為進(jìn)一步純化和鑒定活性成分奠定了基礎(chǔ)。項(xiàng)目組成員學(xué)習(xí)刻苦，查閱文獻(xiàn)和動(dòng)手實(shí)踐能力均較強(qiáng)，儀器使用熟練，具有很好地分析問題和解決問題的能力，有力地保證了項(xiàng)目的實(shí)施和開展。 導(dǎo)師簽字： 年 月 日六、院系推薦意見院系蓋章（簽字）：年 月 日七、學(xué)校評(píng)審意見學(xué)校蓋章（簽字）：年 月 日 八、申請(qǐng)者承諾本人保證上述填報(bào)內(nèi)容的真實(shí)性。如果獲得資助，我與本項(xiàng)目組的全體成員將嚴(yán)格