IFN-γ調(diào)節(jié)THP-1細胞應(yīng)答沙門氏傷寒菌

1、IFN-調(diào)節(jié)THP-1細胞應(yīng)答沙門氏傷寒菌    李鐵民江崎孝行 摘要目的：為了探討IFN-在增強宿主防御沙門氏傷寒菌感染中的作用機制。方法：采用體外細胞培養(yǎng)方法研究了IFN-對THP-1細胞應(yīng)答沙門氏傷寒菌的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)IFN-顯著促進THP-1細胞及PMA分化的THP-1細胞內(nèi)化和殺傷沙門氏傷寒菌，并明顯增強沙門氏傷寒菌誘導(dǎo)PMA分化的THP-1細胞產(chǎn)生TNF-和增強誘導(dǎo)THP-1細胞及PMA分化的THP-1細胞產(chǎn)生IL-12。結(jié)論：IFN-在調(diào)節(jié)宿主單核吞噬細胞應(yīng)答沙門氏傷寒菌感染中起著重要作用。 關(guān)鍵詞干擾素沙門氏傷寒菌細胞因子 中國圖書

2、分類號R392.11 Regulation of THP-1 cells by IFN- in response to Salmonella typhi strains LI Tie-Min,Tarayuki Ezaki.Department of Biology,Liaoning University,Shenyang 110036.Department of Microbiology,Gifu University School of Medicine,Japan 500 AbstractObjective:To research the enhancing mechanisms of h

3、ost defence against Salmonella typhi infection by IFN-.Methods:The regulatory role of THP-1 cells by IFN- in response to Salmonella typhi was researched in vitro.Results:IFN- significantly enhanced the activities of THP-1 cells and PMA differentiated THP-1 cells to internalize and kill Salmonella ty

4、phi strains, and also increased the production of TNF- induction in PMA differentiated THP-1 cells and the production of IL-12 induction by Salmonella typhi strains in THP-1 cells and PMA differentiated THP-1 cells.Conclusion:IFN- plays an important role in the regulation of mononuclear phagocytes i

5、n response to Salmonella typhi infection. Key wordsIFN-Salmonella typhiCytokine IFN-激活宿主免疫在應(yīng)答沙門氏菌感染中起著重要作用。動物實驗結(jié)果表明，沙門氏傷寒菌感染的小鼠早期注射外源IFN-，淋巴結(jié)中的細菌數(shù)量明顯減少，抗IFN-抗體中和循環(huán)的IFN-，小鼠失去抵抗低劑量細菌感染能力，IFN-基因失活的小鼠對沙門氏傷寒菌感染高度易感，而且Ity缺陷(Itys)小鼠明顯比Ityr小鼠易感沙門氏傷寒菌1-3。Kita等人發(fā)現(xiàn)，Itys小鼠產(chǎn)生的IFN-明顯低于Ityr小鼠產(chǎn)生的IFN-4，來源于兩種小鼠的居住吞噬細

6、胞對胞內(nèi)沙門氏傷寒菌的殺傷結(jié)果也顯示，Ityr小鼠的吞噬細胞殺傷胞內(nèi)菌能力明顯高于Itys小鼠的吞噬細胞5。這些資料充分證實了IFN-在機體防御沙門氏傷寒菌感染中的重要作用，但IFN-增強宿主免疫的機制仍不十分清楚。本文通過體外細胞培養(yǎng)方法研究了IFN-對THP-1細胞應(yīng)答沙門氏傷寒菌的調(diào)節(jié)作用。 1材料與方法 1.1細胞系和菌株THP-1細胞，人類單核細胞白血病細胞系，本室保存，常規(guī)傳代培養(yǎng)在含10%FBS(GIBCO，美國)和50 g/ml慶大霉素的RPMI 1640(GIBCO，美國)培基中。Gifu 10007菌株為本室保存的野生型沙門氏傷寒菌菌株。 1.2沙門氏傷寒菌培養(yǎng)物的制備挑取

7、Gifu 10007單個菌落接種于SOB液體培基中，37、5%CO2靜止過夜培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接到新鮮SOB液體培基中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，達到對數(shù)生長期。在感染試驗中取出適量培養(yǎng)物，PBS洗1次，懸浮在RPMI 1640中，同時取培養(yǎng)物，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，涂平板，過夜培養(yǎng)后計數(shù)菌落數(shù)，以確定培養(yǎng)物中的細菌濃度。 1.3THP-1細胞的制備離心收獲培養(yǎng)4 d的THP-1細胞，用預(yù)溫的RPMI 1640洗2次，計數(shù)細胞數(shù)，懸在含有10%FBS和50 g/ml慶大霉素(或不含)的RPMI 1640培基中，使細胞濃度達2.0×106 ml-1或2.3×106 ml-1。 1.4PMA 處理THP-

8、1細胞在細胞懸液中加入適量PMA(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate,Wako,日本)，使終濃度達到160 nmol/L，然后接種細胞懸液到組織培養(yǎng)板中，37、5%CO2條件下孵育48 h后，用預(yù)溫的RPMI 1640培基洗細胞3次。 1.5IFN-活化THP-1細胞和PMA分化的THP-1細胞在THP-1細胞或PMA分化的THP-1細胞中加入濃度為1 000 U/ml的IFN-(人類重組IFN-，Genzyme,美國)，37、5%CO2條件下孵育24 h，細胞經(jīng)預(yù)溫的RPMI 1640培基洗1次后，用于感染試驗。 1.6Gifu 10007菌感染細胞THP-1細胞

9、、IFN-活化的THP-1細胞、PMA分化的THP-1細胞和IFN-活化的PMA分化的THP-1細胞的感染，是在洗后的細胞中加入適量的Gifu 10007菌培養(yǎng)物，使細胞與細菌的比例約為1：10，37、5%CO2條件下孵育1 h，使細胞被感染。用預(yù)溫的RPMI 1640培基洗細胞3次后，加入含10%FBS和50 g/ml慶大霉素的RPMI 1640培基，繼續(xù)孵育在37、5%CO2條件下，此時作為細菌感染細胞后的起始時間。 1.7內(nèi)化及胞內(nèi)存活測定在細菌感染細胞后的不同時間點，去除培養(yǎng)上清，加入1%Triton X-100溶液，室溫保持10 min，以裂解細胞釋放胞內(nèi)菌。稀釋細胞裂解物達適當(dāng)濃度

10、，接種到HI平板上，37過夜培養(yǎng)，計數(shù)生長的菌落數(shù)(以CFU/ml表示)。 1.8細胞因子的誘導(dǎo)及檢測2.0×106 THP-1細胞、IFN-活化的THP-1細胞、PMA分化的THP-1細胞和IFN-活化的PMA分化的THP-1細胞，經(jīng) Gifu 10007菌感染后24 h，收集培養(yǎng)上清，保存于-80。用TNF-和IL-12檢測試劑盒(Biotrak,英國)按其說明進行操作，酶標檢測儀(Pynatech MR5000,美國)上分別測定樣品的TNF-和IL-12含量。 2結(jié)果 2.1IFN-調(diào)節(jié)THP-1細胞內(nèi)化Gifu 10007菌實驗結(jié)果表明，IFN-顯著增強THP-1細胞和PMA

11、分化的THP-1細胞內(nèi)化Gifu 10007菌(圖1)。 2.2IFN-調(diào)節(jié)THP-1細胞殺傷胞內(nèi)Gifu 10007菌實驗發(fā)現(xiàn)，Gifu 10007菌在THP-1細胞中增殖，但在IFN-活化的THP-1細胞中其增殖明顯受到抑制。IFN-顯著增強PMA分化的THP-1細胞殺傷胞內(nèi)Gifu 10007菌(表1)。 2.3IFN-對Gifu 10007菌誘導(dǎo)THP-1細胞產(chǎn)生細胞因子的調(diào)節(jié)表2表明，Gifu 10007菌既不誘導(dǎo)THP-1細胞，也不誘導(dǎo)IFN-活化的THP-1細胞產(chǎn)生TNF- ，但可誘導(dǎo)PMA分化的THP-1細胞產(chǎn)生TNF-，IFN-顯著增強PMA分化的THP-1細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生 &#

12、160;    圖1IFN-對THP-1細胞內(nèi)化Gifu 10007菌株的影響 Fig.1Effect of IFN- on internalization of Gifu 10007 strains Note:A.THP-1 cells;B.THP-1 cells activated by IFN-；C.PMA differentiated THP-1 cells;D.PMA differentiated THP-1 cells activated by IFN-；*P<0.05,*P<0.01 表1IFN-對Gifu 10007菌株存活在THP-1

13、細胞內(nèi)的影響 Tab.1Effect of IFN- on intracellular survival of Gifu 10007 inside THP-1 cells Cell states 1 h postinfection 24 h postinfection % survival CFU/ml() (±s) THP-1 cells 4.16×104 11.50×104 257.80±7.83 THP-1 cells activated by IFN- 7.25×104 11.49×104 158.30±9.541)

14、 PMA differentiated THP-1 cells 1.15×105 4.00×104 34.88±1.08 PMA differentiated THP-1 cells activated by IFN- 2.18×105 1.53×104 6.98±1.021) Note:1)P<0.01 表2IFN-對Gifu 10007菌株誘導(dǎo)THP-1細胞產(chǎn)生TNF-和IL-12的影響(±s) Tab.2Effect of IFN- on production of TNF- and IL-12 inductio

15、n by Gifu 10007 in THP-1 cells (±s) Cell states TNF-(pg/ml) IL-12(pg/ml) THP-1 cells 0.00 51.24±9.08 THP-1 cells activated by IFN- 0.00 1 104.55±77.232) PMA differentiated THP-1 cells 133.22±22.52 59.08±8.02 PMA differentiated THP-1 cells activated by IFN- 1 517.69±89.0

16、92) 117.02±11.721) Note:1) P0.05, 2)P0.01 TNF-。IFN-既可顯著增強Gifu 10007菌誘導(dǎo)THP-1細胞產(chǎn)生IL-12，也可增強PMA分化的THP-1細胞產(chǎn)生IL-12。 3討論 單核吞噬細胞是機體防御胞內(nèi)菌感染的主要細胞，而且實驗已充分證實，宿主對沙門氏傷寒菌感染的應(yīng)答需要IFN-參與1-4，但IFN-如何調(diào)節(jié)單核吞噬細胞抵御沙門氏傷寒菌感染仍不十分清楚。 我們以前的實驗結(jié)果表明，IFN-增強THP-1細胞CD14表達6。最近Schiff等人報道，CD14介導(dǎo)THP-1細胞吞噬G-菌7，所以在我們的實驗結(jié)果中，IFN-增強THP-1

17、細胞和PMA分化的THP-1細胞內(nèi)化沙門氏傷寒菌可能與IFN-增強THP-1細胞CD14表達有關(guān)。Ishibashi和Arai報道，IFN-增強小鼠巨噬細胞殺傷胞內(nèi)沙門氏傷寒菌活性是增強含菌吞噬體與溶酶體的融合水平8。我們的實驗結(jié)果表明，IFN-明顯增強THP-1細胞抑制胞內(nèi)沙門氏傷寒菌生長，顯著增強PMA分化的THP-1細胞殺傷胞內(nèi)沙門氏傷寒菌。如果IFN-增強THP-1細胞殺傷胞內(nèi)沙門氏傷寒菌活性是依賴增強吞噬體與溶酶體融合水平的機制，那么，PMA分化的THP-1細胞殺傷胞內(nèi)沙門氏傷寒菌活性可能與PMA促進THP-1細胞溶酶體成熟有關(guān)，因為我們實驗發(fā)現(xiàn)，PMA促進THP-1細胞分化為成熟巨

18、噬細胞(文中未表明)，我們正在進行這方面研究。 我們的實驗結(jié)果表明，IFN-不增強沙門氏傷寒菌誘導(dǎo)THP-1細胞產(chǎn)生TNF-，但顯著增強沙門氏傷寒菌誘導(dǎo)THP-1細胞和PMA分化的THP-1細胞產(chǎn)生IL-12，然而，增強誘導(dǎo)THP-1細胞產(chǎn)生IL-12明顯高于誘導(dǎo)PMA分化的THP-1細胞產(chǎn)生IL-12。這些實驗結(jié)果提示，單核細胞的分化成熟程度影響TNF-表達，但不影響IL-12表達；兩種細胞因子的誘導(dǎo)表達均需IFN-作為活化信號；PMA雖然可促進THP-1細胞分化成熟，但不增強IL-12表達，而且可能在IL-12產(chǎn)生的某個環(huán)節(jié)上PMA限制IFN-活化的THP-1細胞表達IL-12，這一實驗結(jié)

19、果與Kubin等人報道的結(jié)果相似9。 我們的實驗結(jié)果充分證實了IFN-在調(diào)節(jié)單核吞噬細胞活性中的重要作用。它一方面直接作用于單核吞噬細胞，增強內(nèi)化和殺傷沙門氏傷寒菌；另一方面，作為細胞活化信號增強沙門氏傷寒菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞因子。近年研究表明，IL-12可誘導(dǎo)Th1細胞和NK細胞產(chǎn)生IFN-，反過來，IFN-又可調(diào)節(jié)單核吞噬細胞產(chǎn)生IL-1210。這樣的正反饋調(diào)節(jié)機制在體內(nèi)既可放大單核吞噬細胞活性，又可維持Th1細胞應(yīng)答，所以，進一步深入研究IFN-對單核吞噬細胞的其它調(diào)節(jié)活性和影響IFN-表達的調(diào)節(jié)因素將對我們充分認識機體對沙門氏傷寒菌應(yīng)答具有十分重要意義。 日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)部微生物學(xué)教研室，日

20、本500 作者簡介：李鐵民，男，39歲，博士生，副教授，主要從事抗感染免疫研究； 江崎孝行，男，48歲，博士，教授，主要研究抗感染免疫 作者單位：遼寧大學(xué)生物系微生物學(xué)教研室，沈陽110036 4參考文獻 1Nauciel C,Espinasse M F.Role of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha resistance to salmonella typimurium infection.Infect Immun,1992;60:450 2Hess J,Ladel C,Midko D et al.Salmonella typ

21、himurium aroA-infection in genetargeted immunodeficient mice:major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacteria clearance independent of intracellular location.J Immunol,1996;156:3321 3Vidal S,Tremblay M L,Govoni G et al.The Ity/Bcg locus:natural resistance to infection with intracell

22、ular parasites is abrogated by disruption of the Nrampl gene.J Exp Med,1995;182:655 4Kita E,Emoto D,Oku F et al.Contribution of interferon gamma and membrane-associated interleukin 1 to the resistance to murine typhoid of Ityr mice.J Leukocyte Biol,1992;51:244 5Van Dissel J,Leijh P C,Van Furth F R.Differences in initial rate of intracellular killing of salmonella typhimurium by resident peritoneal macrophages from various mouse strains.J Immunol,1985;134:3404 6Hirose K,Ezaki T,Miyake M et al.Survival of Vi-capsulated and Vi-dele ted salmonella typhi