人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞雙向電泳飛行時(shí)間質(zhì)譜研究

1、人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞雙向電泳飛行時(shí)間質(zhì)譜研究                        作者：楊拴盈，田應(yīng)選，南巖東，卜麗娜，霍樹(shù)芬，阮禹松 【摘要】  目的 初步分析人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)情況，從蛋白組水平探討肺腺癌發(fā)病的分子機(jī)制。方法 應(yīng)用2DE技術(shù)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞總蛋白進(jìn)行分離，獲得蛋白質(zhì)表達(dá)譜；應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)

2、間質(zhì)譜(MALDITOFMS)結(jié)合生物信息學(xué)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。結(jié)果 3塊膠平均蛋白斑點(diǎn)數(shù)為1138±49，平均匹配點(diǎn)數(shù)為986±32，匹配率為85.8%。隨機(jī)選取背景清晰、分辨清楚、蛋白含量較高的20個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行MALDITOFMS分析，共獲得了18個(gè)肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)。將PMFs質(zhì)量數(shù)據(jù)通過(guò)Aldente軟件查詢SWISSPROT數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)匹配片段及氨基酸序列覆蓋率等，初步鑒定出15種蛋白質(zhì)。根據(jù)功能，這些蛋白質(zhì)可分為：基本代謝相關(guān)的酶類：果糖2磷酸醛縮酶、視網(wǎng)醛脫氫酶1(RALDH1)、吡多醛激酶；細(xì)胞骨架類：蛋白細(xì)胞角蛋白8(CK8)、2鏈微管蛋白；應(yīng)激相關(guān)蛋白：

3、蛋白二硫化物異構(gòu)酶A3(PDIA3)； 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子：膜聯(lián)蛋白1(ANX1)、膜聯(lián)蛋白4(ANX4)；分子伴侶：熱休克蛋白60(HSP60)、熱休克蛋白1、抑制素(PHB)；轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白：不均一性核糖核蛋白H(hnRNP H)；雜類：Rgr protein、NPM、PCBP1。結(jié)論 應(yīng)用2DE/MALDIMS方法獲得了較為理想的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞2DE蛋白質(zhì)表達(dá)譜，初步鑒定了15種蛋白質(zhì)。 【關(guān)鍵詞】  人肺腺癌細(xì)胞系；蛋白質(zhì)組學(xué)；雙向電泳；基質(zhì)輔助激光解吸離子化電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；肽指紋圖譜A proteomic study on human lung adenocarc

4、inomacell line A549 by 2DE and MALDITOFMSABSTRACT: Objective  To analyze protein profiles in human lung adenocarcinoma cell line A549 cell and to investigate molecular mechanism of pulmonary adenocarcinoma genesis at the level of proteomics. Methods  Two dimensional gel electrophoresis (2D

5、E) was used to separate totally soluble proteins extracted from A549 cell, and peptide mass fingerprintings (PMFs) were obtained and then some spots on 2DE gels were identified by matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS) combined with bioinformatics. Res

6、ults  The average total number of proteins spots was 1138±49, average paired spots 986±32, and matched rate 85.8% among the three gels. 20 spots with high resolution and reproducibility were analyzed using MALDITOFMS, 18 spots yielded PMFs, and 15 proteins were preliminarily identifie

7、d and further classified into 7 categories based on their functions: enzymes related to cell metabolism: fructosebisphosphate aldolase A, retinal dehydrogenase 1(RALDH1), pyridoxal kinase; cytoskeleton proteins: type II cytoskeletal 8(CK8), tubulin beta2 chain; proteins related to stress: protein di

8、sulfideisomerase A3 (PDIA3); signal tranduction molecules: annexin A1(ANX1)and annexin A4(ANX2); chaperones: 60ku heat shock protein(HSP60), heat shock protein beta1, prohibitin(PHB); proteins related to transcription and translation: heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H(hnRNP H); others: Rgr p

9、rotein, nucleophosmin(NPM), poly(rC)binding protein 1(PCBP1). Conclusion  A clear, wellresolved protein profile in A549 cell was obtained by 2DE and 15 proteins were identified using PMFs.KEY WORDS: human lung adenocarcinoma cell line; proteomics; two dimensional gel electrophoresis; matrixassi

10、sted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS); peptide mass fingerprinting肺癌是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤1，腺癌是肺癌中最主要的組織學(xué)類型之一。由于肺腺癌發(fā)病機(jī)制不明、轉(zhuǎn)移早、對(duì)放療及化療不敏感，因此，已成為制約肺癌5年生存率的主要因素。近年來(lái)，由于蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)技術(shù)具有高通量、高重復(fù)性及高靈敏性等特點(diǎn)，能夠從整體水平(蛋白)分析蛋白質(zhì)的變化，故其已成為探討腫瘤發(fā)病機(jī)制和篩選其早期診斷標(biāo)志物的強(qiáng)有力工具23。在本研究中，我們應(yīng)用雙

11、向電泳(two dimensional gel electrophoresis, 2DE)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry, MALDITOF MS)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)方法，檢測(cè)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，旨在從蛋白水平探討腺癌的發(fā)病機(jī)制。1  材料與方法1.1  材料1.1.1  細(xì)胞  人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞引自西交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院癌癥研究所，用含10%(體積分?jǐn)?shù))小牛血清的

12、RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1.1.2  主要儀器  UP 200s超聲破碎儀(Dr.Hielscher GmbH)；Ultrospec 2100proUV/Visible Spectrometer (Amersham Bioscience)；IPGphor等電聚焦儀(Amersham Bioscience公司)；Hoefor SE600垂直電泳儀(Amersham Biosciences)；ScanMaker 8700 掃描儀(MICROTEC)；Model 250 pH計(jì)(Thermo Orion)；WR2001型溶劑過(guò)濾器(上海嘉鵬科技有限公司)；Milli

13、Q超純水發(fā)生器(Millipore)；VoyagerDETM MALDITOF質(zhì)譜儀(Applied Biosystems)；CentriVap Concentrator(Labconco公司)；凝膠圖像分析軟件ImageMaster(Amersham Biosciences公司)；超速低溫離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；冷凍真空干燥機(jī)(美國(guó)Heto公司)。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(REVCOELITE2)，倒置相差顯微鏡(NIKon/TMS)。1.1.3  試劑  尿素(Urea)、硫脲(thiourea)、三羥基甲基氨基甲烷堿(Trisbase)、EDTA、Protease In

14、hibitor Mix、CHAPS、TX100、十二烷基硫酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)均購(gòu)自Promega公司；溴酚藍(lán)、甘氨酸、過(guò)硫酸銨均購(gòu)自美國(guó)AMRESCO；丙烯酰胺(Arc)、甲叉雙丙烯酰胺、碘乙酰胺(iodoacetamide)、硝酸銀、蛋白質(zhì)組學(xué)級(jí)(proteomics grade)TPCK胰蛋白酶(TPCKtrypsin)、胰蛋白酶、三氟乙酸(TFA)、基質(zhì)氰基4羥基肉桂酸(CHCA)均購(gòu)自Sigma公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖、甲醇、冰乙酸、固相pH梯度干膠條(IPG strip, 13cm, pH3-10)、IPG緩沖液(pH3-10)均購(gòu)自Amersham PharmaciaB

15、iotech公司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)購(gòu)自上海伯奧生物制品公司；甘油、碳酸氫銨等其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司。所有溶液均用Milli Q水配制。1.2  方法1.2.1  細(xì)胞總蛋白的提取  用含10%(體積分?jǐn)?shù))小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)A549細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，胰酶消化，室溫1000r/min離心10min，棄上清，重復(fù)3次；將1×107個(gè)細(xì)胞重懸于100L預(yù)冷裂解緩沖液(8mol/L urea， 40g/L CHAPS，40mmol/L Trisb

16、ase，65mmol/L DTT，0.5% Pharmalyte pH3-10，1mmol/L PMSF)中，在4靜置30min；冰浴中超聲破碎10s(每次5s，間隔5s)；4 15000r/min離心20min，取上清；Bradford 法蛋白定量，分裝，-80凍存?zhèn)溆谩?.2.2  2DE  用13cm固定膠條(pH3-10)，上樣量45g。參照IPGphor等電聚焦系統(tǒng)指南進(jìn)行。最大電流60A/IPGstrip；水化和聚焦在20自動(dòng)進(jìn)行?？傠妷簳r(shí)間積30000Vh，最后在8000V下進(jìn)行等電聚焦。將膠條進(jìn)行兩步平衡后，移至12.5%分離膠的上端，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙

17、烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)。電泳完成后，按蛋白質(zhì)銀染試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行銀染。1.2.3  凝膠圖像分析  圖像掃描后，在ImageMaster 2D Elite 4.01分析軟件輔助下，進(jìn)行背景消減、點(diǎn)檢測(cè)、匹配、獲取斑點(diǎn)位置坐標(biāo)等分析。1.2.4  質(zhì)譜分析  對(duì)銀染蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶切，脫色，還原，烷基化，酶解(用 TPCK胰蛋白酶)、萃取及凍干，將制備好的樣品置于VoyagerDE MALDITOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析。采用線性模式、正離子譜測(cè)定，離子源加速電壓為20kV，離子延遲提取500ns，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50次，以多肽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(ABI

18、公司)為外標(biāo)。1.2.5  肽質(zhì)量指紋圖譜的數(shù)據(jù)庫(kù)查詢  將結(jié)果通過(guò)Aldente軟件進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprintings, PMF)查詢。數(shù)據(jù)庫(kù)選擇SWISSPROT，PMF中的肽片段質(zhì)量控制在1000-5000，肽片段分子質(zhì)量最大容許誤差(Peptide tol.)控制在±0.5u，Enzyme選擇胰酶，酶解片段不完全(missed cleavages)選擇為1個(gè)，物種來(lái)源(taxonomy)選擇人類，離子選擇M+H+和平均(average)，固定修飾(fixed modifications)選擇脲甲基半胱氨酸(carb

19、amidomethylCys)。2  結(jié)果2.1  人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞總蛋白的2DE圖譜  圖1為A549細(xì)胞總蛋白的銀染2DE圖譜。在相同條件下，對(duì)A549細(xì)胞總蛋白進(jìn)行了3次2DE檢測(cè)。經(jīng)圖像掃描后，應(yīng)用ImageMaster 2D Elite 4.01分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，結(jié)果顯示3塊膠的平均蛋白斑點(diǎn)數(shù)為1138±49，用其中1塊膠作為參考膠進(jìn)行匹配，平均匹配點(diǎn)數(shù)為986±32，匹配率為85.8%。圖1  人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞總蛋白雙向電泳圖譜（略）Fig.1 2DE gels of total protein extracts from human lung adenocarcinoma cell line A5492.2  蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的MALDITOFMS分析  從3塊膠上匹配的蛋白點(diǎn)中隨機(jī)選取背景清晰、分辨清楚、蛋白含量較高、重復(fù)性較好的20個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。共獲得了18張PMF。圖2是1號(hào)蛋白質(zhì)點(diǎn)的PMF。2.3  數(shù)據(jù)庫(kù)查詢鑒定蛋白質(zhì)  對(duì)20個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDITOFMS分析。結(jié)果顯示，大多數(shù)PMF圖背景很低，峰信號(hào)較強(qiáng)，以1000-5