分子修飾的重組百日咳毒素S1亞單位的生物學(xué)和免疫學(xué)特性

1、分子修飾的重組百日咳毒素S1亞單位的生物學(xué)和免疫學(xué)特性    于康震B(yǎng)urnette W NKaslow H RYilma T D中國圖書分類號(hào)R378.4Q784摘要目的：對(duì)重組桿狀病毒表達(dá)的經(jīng)多種信號(hào)序列修飾的天然和變異百日咳毒素(PT)S1亞單位(rS1)的生物學(xué)及免疫學(xué)特性作出評(píng)價(jià)。方法：應(yīng)用生物化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)與方法對(duì)這些rS1的酶活性、分泌性和免疫原性等做了系統(tǒng)鑒定。結(jié)果：rS1變異子無可檢出的酶活性；所有rS1均不能由細(xì)胞分泌，可從細(xì)胞膜組分中大量檢出，但不能從可溶性胞漿蛋白組分或細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢出；rS1分子內(nèi)部含有3個(gè)疏水性區(qū)域；rS1

2、雖不能與B寡聚體結(jié)合形成PT全毒素，但均能誘導(dǎo)抗PT免疫應(yīng)答。結(jié)論：這些rS1極可能以膜蛋白形式存在，其非分泌性與分子內(nèi)部的疏水性區(qū)域有關(guān)；所有rS1均保持其免疫原性。關(guān)鍵詞百日咳毒素S1亞單位生物學(xué)特性免疫應(yīng)答B(yǎng)iological and immunological characterization of genetically altered S1 subunits of pertussis toxin expressed in recombinant baculovirusesYU Kang-Zhen.Harbin Veterinary Research Institute of Chi

3、nese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001Burnette W N, Kaslow H R, Yilma T D.International Laboratory of Molecular Biology for Tropical Disease Agents, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, CA 95616 USAAbstractObjective:To make a further study on the biological a

4、nd immunological aspects of the molecularly modified native and mutant rS1 subunits abundantly expressed by recombinant baculoviruses in insect cells and larvae. Methods:Biochemical and immunological techniques were used for characterization of enzyme activity, secretion and immunogenicity of the rS

5、1. Results:The mutant rS1 analogs had no detectable enzymatic activity. None of the rS1 subunits were secreted from the eukaryotic cells. These rS1 proteins were found in membrane fractions, but not in either the soluble cytoplasmic or culture supernatant fractions. Furthermore, 3 hydrophobic domain

6、s were found within the rS1 molecules. Although none of the rS1 subunits were capable of associating with authentic B oligomer to form PT holotoxin, they induced an immune response to PT in Balbc mice. Conclusion:Those rS1 subunits appeared to be integrated into the cell membrane,and their none-secr

7、etion might be contributed by the hydrophobic domains. The immunogenicity of the all rS1 subunits was still maintained.Key wordsPertussis toxinS1 subunitBiological characterizationImmune response百日咳是一種在嬰兒中具有很高死亡率的呼吸系統(tǒng)疾病，其病原為百日咳桿菌，該菌能產(chǎn)生包括百日咳毒素(PT)在內(nèi)的十多種毒性因子。PT既是百日咳桿菌的主要毒性因子，又是百日咳疫苗的主要保護(hù)性抗原。S1亞單位是PT中最

8、大的一個(gè)亞單位，PT的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性和主要保護(hù)性決定簇即位于該亞單位上。傳統(tǒng)百日咳疫苗的毒副作用與S1亞單位的酶活性有關(guān)。Burnette及其同事通過單一氨基酸替換(R9K)技術(shù)構(gòu)建了一種S1變異子，其酶活性降至陰性對(duì)照水平，但仍保持主要的保護(hù)性決定簇1。這一突破為有效和安全的新型百日咳疫苗的研制開辟了新途徑。在先前的研究中，我們對(duì)天然及變異S1編碼基因進(jìn)行了一系列分子修飾，并應(yīng)用重組桿狀病毒(rBV)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了這些亞單位在昆蟲細(xì)胞中的高水平表達(dá)。本研究中，我們進(jìn)一步對(duì)這些重組S1亞單位(rS1)的生物學(xué)及免疫學(xué)特性作了鑒定，為評(píng)價(jià)其作為安全免疫原的潛能提供了分子生物學(xué)依據(jù)。1材料與方

9、法1.1細(xì)胞系、病毒昆蟲細(xì)胞系Sf21用于rS1亞單位的表達(dá)，中國地鼠卵(CHO)細(xì)胞、Vero細(xì)胞及牛水皰性口炎病毒(VSV-NJ株)用于rS1亞單位生物學(xué)特性的鑒定。1.2S1亞單位基因片段的修飾和表達(dá)8種S1亞單位編碼基因片段的遺傳學(xué)修飾如圖1所示，其在rBV中的高效表達(dá)見文獻(xiàn)2。  圖1S1亞單位編碼基因的分子修飾Fig.1Modification of S1 DNA molecules1.3ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性分析用于評(píng)價(jià)各rS1亞單位的酶活性，具體方法參照文獻(xiàn)3進(jìn)行，以牛的Transducin作為ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶的底物。1.4rBV感染培養(yǎng)物各組分的制備細(xì)胞

10、膜及其它亞細(xì)胞成分的制備按報(bào)道的方法進(jìn)行4。用各rBV感染Sf21細(xì)胞2，低速離心(280×g)收集細(xì)胞沉淀后進(jìn)行勻漿。全細(xì)胞裂解物(組分1)經(jīng)離心(110 000×g)后形成兩部分，一為上清液(組分2，可溶性胞漿蛋白)，將其用Centricon-10濾膜(截留分子量為10 kD，Amicon)超濾濃縮10倍；另一部分為沉淀(組分3，不溶性蛋白)，將其重懸于1.42mol/L STE(1.42 mol/L蔗糖，5mmol/L Tris和1mmol/L EDTA)并離心(110000×g),離心后形成新的沉淀(組分4，亞細(xì)胞成分)和一條含膜組分(組分6)的條帶。對(duì)最

11、初低速離心所獲得的上清再進(jìn)行超速離心(110000×g)，新上清用Centriprep-10(截留分子量為10kD，Amicon)濾膜濃縮100倍(組分5)。同時(shí)用各rBV感染昆蟲幼蟲2，收獲其血淋巴(組分7)。用免疫印跡技術(shù)檢測以上各組分中的rS1蛋白。1.5全毒素組裝分析即測定這些rS1與PT的B寡聚體結(jié)合能力5。組裝的全毒素用免疫印跡技術(shù)檢測，同時(shí)對(duì)反應(yīng)混合物作CHO聚集效應(yīng)分析6。1.6rS1亞單位免疫學(xué)特性試驗(yàn)1.6.1動(dòng)物免疫為檢測rS1的免疫原性及佐劑活性，以rVSV-G(rBV表達(dá)的VSV糖蛋白)和下列各rS1的混合物經(jīng)腹腔免疫：帶有天然信號(hào)序列的天然rS1(rS11

12、組)，帶有天然信號(hào)序列的變異rS1(rS11-4組)，帶有流感病毒信號(hào)序列的變異rS1(rS13-4組)，純化的PT(PT組)，純化的S1(S1組，陽性對(duì)照)和磷酸鹽緩沖液(rVSV-G組，陰性對(duì)照)。每只鼠免疫劑量為rS1 30 g(據(jù)SDS-PAGE凝膠掃描結(jié)果估算)，PT或S1亞單位1 g。小鼠在免疫前經(jīng)眶后靜脈采血1次，免疫后每周以相同的途徑采血，并進(jìn)行白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)。1.6.2ELISA試驗(yàn)用以評(píng)價(jià)免疫鼠的抗PT或VSV-G的免疫應(yīng)答。簡言之，以含1 g/ml PT或VSV-G的碳酸鹽緩沖液(pH9.6)包被96孔酶標(biāo)板，然后以含5%脫脂奶粉的TBS(pH7.4)封閉，再將不同

13、稀釋度的鼠血清樣品加入各孔,然后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG,按常規(guī)顯色和測定。      1.6.3CHO細(xì)胞聚集抑制試驗(yàn)用以檢測抗PT的中和性抗體。試驗(yàn)在96孔組織培養(yǎng)板上按文獻(xiàn)6報(bào)道的方法進(jìn)行。PT的血清中和(SN)價(jià)以可完全抑制CHO細(xì)胞聚集的血清終點(diǎn)稀釋度的倒數(shù)表示。1.6.4VSV蝕斑減少試驗(yàn)用以分析rS1能否增強(qiáng)小鼠對(duì)VSV的體液免疫應(yīng)答。免疫鼠血清與VSV-NJ在96孔板上混合后作用1 h，然后用該血清病毒混合物感染Vero細(xì)胞單層，VSV蝕斑用結(jié)晶紫染色后計(jì)數(shù)。VSV SN滴度以無病毒蝕斑形成時(shí)的終點(diǎn)血清稀釋度的倒數(shù)表示。1.7疏

14、水性分析為探討rS1亞單位不能分泌的可能原因，我們利用計(jì)算機(jī)輔助分析技術(shù)和GCG程序(Wisconsin package)對(duì)本研究中具有代表性的rS13-4亞單位分子的疏水性作了分析。2結(jié)果2.1rS1亞單位的酶活性ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶試驗(yàn)表明，所有天然序列的rS1亞單位均具有酶活性，而所有變異的rS1亞單位均無可檢出的酶活性。2.2rS1蛋白的亞細(xì)胞分布及其分泌性對(duì)8種rBV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的不同組分進(jìn)行了檢測，結(jié)果是一致的(圖2)：在昆蟲血淋巴、高度濃縮的培養(yǎng)上清及胞漿可溶性蛋白組分中未檢出任何rS1亞單位，而在膜組分中檢出了大量的rS1蛋白。結(jié)果表明，所有rS1亞單位(無論有無信號(hào)序列)均

15、不能分泌，而是膜結(jié)合性的。 圖2rS1蛋白在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物中的亞細(xì)胞分布Fig.2Subcellular distribution of rS1 proteins in different fractions of insect cell culturesNote：subcellular fractions are indicated as 17, see 1.4 in methods for detail2.3全毒素裝配分析未能從含rS1的全毒素組裝反應(yīng)混合物中檢出PT全毒素，而從含天然S1的反應(yīng)混合物中檢出了PT。CHO細(xì)胞聚集試驗(yàn)表明，25%50%的天然S1可與B寡聚體組裝成P

16、T全毒素，而rS1亞單位的全毒素裝配均處于本底水平(0.4%)。因此，所有rS1亞單位均缺乏與B寡聚體結(jié)合的能力。2.4rS1亞單位的白細(xì)胞增多活性WBC計(jì)數(shù)表明，注射天然PT 1 w后的小鼠具有很高的WBC刺激指數(shù)(高達(dá)18.34)，而各種rS1和天然S1組以及陰性對(duì)照組小鼠的該指數(shù)僅為1.052.62,這表明所有rS1亞單位均無誘導(dǎo)白細(xì)胞增多的活性。2.5rS1亞單位的免疫原性在PT ELISA和CHO細(xì)胞聚集抑制試驗(yàn)中，rS1試驗(yàn)組和陽性對(duì)照組的抗PT抗體和中和抗體滴度在免疫后第2周開始升高，這種持續(xù)性升高呈時(shí)間依賴性。天然S1和各rS1免疫鼠的抗PT抗體應(yīng)答相似，但PT組的抗體應(yīng)答更強(qiáng)

17、。同樣，SN滴度在天然S1和rS1免疫鼠為16，而在PT免疫組則高達(dá)256以上。試驗(yàn)中還觀察到低稀釋的鼠血清(18)對(duì)CHO細(xì)胞的毒性作用。對(duì)6組鼠血清的抗VSV總抗體(VSV ELISA)及中和抗體(VSV蝕斑減少試驗(yàn))分析表明，僅天然PT具有增強(qiáng)抗VSV免疫應(yīng)答的活性(免疫后第2周SN滴度達(dá)320以上)，而各rS1、天然S1和陰性對(duì)照組則無此活性(SN滴度為4080)，這表明所有rS1亞單位均無天然PT全毒素的佐劑活性。2.6rS1亞單位的疏水性計(jì)算機(jī)輔助分析表明，rS13-4分子中至少存在4個(gè)疏水性區(qū)域：1個(gè)位于病毒信號(hào)肽內(nèi)，1個(gè)在分子中間，2個(gè)位于羧基端(圖3)。其中區(qū)域2和3分別含有

18、19(201219)和14(239252)個(gè)氨基酸殘基，其長度與疏水性強(qiáng)度足以將rS1分子嵌在細(xì)胞膜中。  圖3rS13-4的親水性和疏水性分析Fig.3Hydrophilicity and hydrophobicity of rS1/3-4 sequence3討論為便于大量制備S1亞單位，我們將流感病毒信號(hào)序列插在天然和變異S1基因上游(rS13、rS11-4)，以期得到分泌性的rS1蛋白。此外，帶有細(xì)菌天然信號(hào)者(rS11和rS11-4)也有可能分泌，攜帶嵌膜序列的rS13A和rS13-4A可望進(jìn)入膜內(nèi)，而無信號(hào)序列的rS12及rS12-4應(yīng)作為胞漿蛋白存在。然而，雖然

19、流感病毒信號(hào)肽可被正確有效地切割2，但在高度濃縮的培養(yǎng)上清及昆蟲幼蟲血淋巴中均未檢出任何rS1蛋白(圖2)。為闡明這些rS1亞單位的亞細(xì)胞分布，我們檢測了感染細(xì)胞培養(yǎng)物的不同組分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rS1存在于每種沉淀和膜組分中，而不存在于胞漿可溶性蛋白成分中(圖2)。計(jì)算機(jī)輔助分析表明，疏水性區(qū)域2和3分別含有19(201219)和14(239252)個(gè)氨基酸殘基，其長度與疏水性強(qiáng)度足以將rS1分子嵌在細(xì)胞膜中(圖3)。為進(jìn)一步闡明這一嵌膜機(jī)制，我們已構(gòu)建一種缺失羧基端疏水區(qū)2和3的rS13-4(結(jié)果另報(bào))?？紤]到rS1蛋白的疏水性以及其在膜組分中的存在和在可溶性胞漿蛋白中的缺乏，我們認(rèn)為rS1亞單位

20、可能以膜結(jié)合蛋白的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。這與rS1在組分4中的存在并不矛盾，因?yàn)樵摻M分中仍然含有大量的細(xì)胞膜成分。我們的推論在帶有流感病毒信號(hào)肽的rS13、rS13-4、rS13A及rS1/3-4A是比較容易理解的：在信號(hào)肽引導(dǎo)下，rS1蛋白被運(yùn)送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，信號(hào)肽切除后，這些蛋白便由ER轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，最后到達(dá)細(xì)胞膜，通過疏水區(qū)或和嵌膜序列而定位于細(xì)胞膜上。按蛋白質(zhì)的經(jīng)典分泌途徑難以理解不含信號(hào)肽的rS12和rS12-4是如何被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜的7。許多研究表明，原核及真核細(xì)胞均可產(chǎn)生缺乏疏水性信號(hào)肽的分泌性蛋白，這些蛋白的運(yùn)送是通過一種叫作ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)

21、運(yùn)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的8，這可能有助于解釋我們的結(jié)果。本研究中rS1缺乏與B寡聚體結(jié)合的能力，這可能是rBV表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的rS1蛋白的膜結(jié)合性導(dǎo)致了其折疊方式的變化，從而引起rS1與B寡聚體體外結(jié)合能力的喪失。我們還對(duì)rS1亞單位的免疫學(xué)特性作了鑒定，本試驗(yàn)表明rS1亞單位均具有免疫原性。rS1蛋白所誘導(dǎo)的抗PT抗體及中和性抗體水平與天然S1誘導(dǎo)的相似，但低于PT誘導(dǎo)的抗體水平。這可能是由于在PT免疫動(dòng)物的同時(shí)存在抗S1及抗B寡聚體的2種免疫應(yīng)答的緣故。同時(shí)發(fā)現(xiàn)rS1亞單位均無免疫增強(qiáng)或白細(xì)胞增多活性，再次驗(yàn)證了只有PT全毒素才具有此類活性。有研究表明，枯草桿菌產(chǎn)生的重組S1亞單位(Bac S1)可激發(fā)

22、小鼠的保護(hù)性免疫應(yīng)答9。我們將開展進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)這些rS1亞單位的免疫保護(hù)性。Burnette W NAmgen Inc.Thousand Oaks, CA 91320 USAKaslow H RSchool of Medicine, Universtiy of Southern California, Los Angeles, CA 90033 USA作者簡介：于康震，男，37歲，研究員，博士生導(dǎo)師作者單位：于康震(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150001)Burnette W NKaslow H RYilma T D(美國加利福尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，

23、Davis, CA 95616 USA)      4參考文獻(xiàn)1Burnette W N, Cieplak W, Mar V L. Pertussis toxin S1 mutant with reduced enzyme activity and a conserved protective epitope. Science, 1988;242:722于康震，Burnette W N, Kaslow H R. 百日咳毒素S1亞單位的分子修飾及其在重組桿狀病毒中的表達(dá).中國免疫學(xué)雜志，1999；15(2)：523Kaslow H R, Lim L K, Moss J. Structure-activity analysis of the activation of petussis toxin. Biochem, 1987；26:1234Ozols J. Preparation of membrane fractions. Me