實(shí)驗(yàn)二總糖和還原糖的測定(DNS)1

1、實(shí)驗(yàn)二 總糖和還原糖的測定 3,5二硝基水楊酸法 一、目的要求：  掌握還原糖和總糖的測定原理，學(xué)習(xí)用比色法測定還原糖的方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理: 在NaOH和丙三醇存在下，3,5二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。   三、試劑和器材 1、試劑 3,5二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取g DNS溶于200ml 2mol/L NaOH溶液中（不

2、適宜用高溫促溶），接著加入到酒石酸甲鈉的熱溶液中（192g就是酸甲鈉溶于500ml水中），再加入5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，搖勻溶解后，冷卻定容至1000ml，暗處保存?zhèn)溆?。葡萄糖?biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100ml，即含葡萄糖為。 6mol/L HCl：取250ml濃HCl（35%38%）用蒸餾水稀釋到500ml。 碘碘化鉀溶液：稱取5g碘，10g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中。 6N NaOH：稱取120g NaOH溶于500ml蒸餾水中。0.1% 酚酞指示劑： 2、材料藕粉，玉米淀粉。 3、器材 WFJ UV2000型分光光度計(jì)

3、，水浴鍋，電爐，15mm×180mm試管。  四、操作方法  1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取5支15mm×180mm試管，按下表加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水。  管號葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液蒸餾水葡萄糖含量 OD540/ml/ml/mg 0 1 010  2   3   4  5102 在上述試管中分別加入DNS試劑，于沸水浴中加熱2min進(jìn)行顯色，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，各加入蒸餾水，搖勻，在540nm波長處測定光吸收值。以蒸餾水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液

4、按同樣顯色操作為空白調(diào)零點(diǎn)。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2、樣品中還原糖的提取準(zhǔn)確稱取 藕粉，放在100ml燒杯中，先以少量蒸餾水(約2 ml)調(diào)成糊狀，然后加入40ml蒸餾水，混勻，于50 恒溫水浴中保溫20min，不時(shí)攪拌，使還原糖浸出混。過濾，將濾液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即為還原糖提取液。  3、樣品總糖的水解及提取準(zhǔn)確稱取玉米淀粉，放在錐形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸餾水15ml，在沸水浴中加熱，取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍(lán)色。水解

5、畢，冷卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到100ml，過濾取濾液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍的總糖水解液，用于總糖測定。  4、樣品中含糖量的測定 取7支15mm×180mm試管，分別按下表加入試劑： 項(xiàng)目空白還原糖總糖0123456樣品溶液/ml01111113,5-二硝基水楊酸試劑/ml2222222 加完試劑后，于沸水浴中加熱2min進(jìn)行顯色，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，各加入蒸餾水，搖勻，在540nm波長處測定光吸收值。測定后，取樣品的光吸收平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的糖量。 5、結(jié)果處理 按下式計(jì)算出樣品中還原糖和總糖的百分含量： 式中：C還原糖或總糖提取液的濃度，mg/ml；V還原糖或總糖提取液的總體積，ml； m樣品重量，g；1000mg換算成g的系數(shù)。  五、注意事項(xiàng) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品含糖量測定應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，一