參參康心膠囊對(duì)小鼠心肌缺血線粒體膜SOD、MDA的影響(1)

1、參參康心膠囊對(duì)小鼠心肌缺血線粒體膜SOD、MDA的影響(1)          作者：蘭云 明海霞 劉喜平 李沛清 廖湘琦【摘要】  目的：觀察參參康心膠囊對(duì)缺血小鼠心肌線粒體丙二醛、超氧化物歧化酶的影響。方法：腹腔注射垂體后葉素（Pit）造成小鼠心肌缺血損傷為模型，測(cè)定心肌線粒體膜超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量。結(jié)果：模型組與空白對(duì)照組相比，MDA明顯升高（p<0.01），參參康心膠囊大、中、小三劑量組與模型組比較MDA含量明顯下降，有顯著性差異，但無明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系

2、。模型組心肌細(xì)胞線粒體SOD活力略有下降，但不明顯，而參參康心膠囊大劑量組SOD活力有顯著增高，而中小劑量不明顯。結(jié)論：參參康心膠囊保護(hù)缺血心肌細(xì)胞線粒體損傷的機(jī)理可能與升高線粒體SOD活性、降低MDA含量有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  參參康心膠囊 心肌缺血 線粒體 丙二醛 超氧化物歧化酶    氧自由基是造成心肌缺血的重要因素之一。細(xì)胞內(nèi)豐富的線粒體對(duì)氧自由基損傷十分敏感1、2，所以通過對(duì)線粒體的代謝、結(jié)構(gòu)及功能變化的研究，既可以了解心肌缺血性損傷的機(jī)制，又可以了解藥物的治療效果。新藥參參康心膠囊來源于名老中醫(yī)驗(yàn)方，由人參等三味藥物組成，經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝加工而成

3、，臨床應(yīng)用多年，對(duì)冠心病、心肌梗死等心肌缺血性疾病有顯著療效。為了近一步明確該方抗心肌缺血損傷的作用機(jī)制，我們觀察了該藥對(duì)缺血心肌線粒體膜氧自由基及脂質(zhì)過氧化的影響，以期進(jìn)一步了解該制劑對(duì)改善心肌缺血的作用機(jī)制，為臨床治療心肌缺血性疾病提供可靠的理論依據(jù)。    1  材料    1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  昆明種普通級(jí)健康小鼠，雌雄各半，體重30.0±2.0g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第14005。    1.2  實(shí)驗(yàn)藥物 

4、 參參康心膠囊：處方由人參等三味藥物按一定的比例組成。由蘭州佛慈制藥股份有限公司制備，蘭州中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)中心監(jiān)制。規(guī)格為0.5g?粒-1(每粒相當(dāng)于生藥1g)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水溶解為120mg生藥/ml。地奧心血康膠囊：成都地奧制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：0503079 代號(hào)022，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z10910051。垂體后葉素：上海第一生化藥業(yè)公司，上海生物化學(xué)制藥廠，批號(hào)：041031。    1.3  主要試劑  丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20050919。超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所，

5、批號(hào)：20050927。    1.4  主要儀器  電子天平（Sartorius BL150，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；離心機(jī)（D-37520 ,德國(guó) ）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，鄭州杜甫儀器廠 ）；紫外分光光度計(jì)（UV-9100，北京瑞利分析儀器公司）。    2  方法    2.1  分組及小鼠心肌缺血模型的建立    昆明種普通級(jí)健康小鼠，60只，體重30.0±2.0g，（蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供）。將動(dòng)物隨

6、機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組（地奧心血康組）、參參康心膠囊小劑量組、參參康心膠囊中劑量組、參參康心膠囊大劑量組共六組，每組10只。參參康心膠囊低劑量組(1.5g生藥/kg)、中劑量組(3g生藥/kg)、大劑量組 (6g生藥/kg)用參參康心膠囊溶液分別按0.25ml/次、0.5ml/次、1ml/次灌胃；陽性對(duì)照組按成人常規(guī)劑量折算后給藥即（0.076g/kg），1ml/次灌胃；空白對(duì)照組與模型組每日給予1ml生理鹽水, 各組每天灌胃2次，連續(xù)一周。參考文獻(xiàn)方法2，模型組、陽性對(duì)照組（地奧心血康組）、參參康心膠囊小劑量組、參參康心膠囊中劑量組、參參康心膠囊大劑量組于末次給藥30min后，

7、腹腔注射垂體后葉素（Pit）30u/kg。    2.2  小鼠心肌細(xì)胞線粒體的分離、提取    參考文獻(xiàn)方法3，注射Pit15min后，將小鼠處死，立即摘取心臟，在冰冷的（4）磷酸緩沖液中洗去血液，濾紙拭干，稱重； 取心臟用眼科小剪刀盡快剪碎，倒入玻璃勻漿管中，加入9倍于心臟重的冰冷勻漿介質(zhì)，將玻璃勻漿管插入盛有冰水混合物的容器中勻漿； 將制備好的勻漿移入2ml離心管，用低溫低速離心機(jī)以2000r/min離心10分鐘，棄沉淀； 取上清液用低溫高速離心機(jī)以10000r/min，4條件下離心15分鐘，棄上清，沉淀物即為線粒體。

8、將分離的線粒體用20倍的冰冷勻漿介質(zhì)制備成混懸液，在04儲(chǔ)存待測(cè)。     2.3  參參康心膠囊對(duì)垂體后葉素模型小鼠心肌細(xì)胞線粒體超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）含量的影響    取各組線粒體混懸液，采用硫代巴比妥酸法，按照南京建成生物工程研究所MDA測(cè)定試劑盒說明書的步驟進(jìn)行測(cè)定。    2.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法    將所測(cè)結(jié)果按試劑盒說明書計(jì)算，采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)，用t檢驗(yàn)。計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±)表示。&

9、#160;   3  結(jié)果    3.1  參參康心膠囊對(duì)垂體后葉素模型小鼠心肌細(xì)胞線粒體超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響    結(jié)果見表1。從表中可見，垂體后葉素所致心肌缺血模型組SOD活力與空白對(duì)照組比較無明顯變化，而參參康心膠囊大劑量組與模型組比較，SOD活性明顯增強(qiáng)，p<0.01。參參康心膠囊的其它兩組與模型組比較SOD活力有一定的增強(qiáng)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1  參參康心膠囊對(duì)Pit模型小鼠心肌細(xì)胞線粒體SOD活性的影響（略）注：與模型組比較*P0.01。 &#

10、160;  3.2  參參康心膠囊對(duì)垂體后葉素模型小鼠心肌細(xì)胞線粒體丙二醛（MDA）含量的影響    結(jié)果見表2。從表中可見，模型組與空白對(duì)照組相比（p<0.01），即說明用垂體后葉素腹腔注射復(fù)制心肌缺血模型成功；陽性對(duì)照組與模型組比較（p<0.01），與參參康心膠囊組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；參參康心膠囊大、中、小三劑量組與模型組比較MDA含量明顯下降有顯著性差異，表明參參康心膠囊對(duì)心肌缺血有明顯防治作用，但參參康心膠囊三劑量組間無顯著性差異。 表2  參參康心膠囊對(duì)Pit模型小鼠線粒體MDA含量的影響（略）注：與空白對(duì)照組相比

11、#P0.01，與模型組比較*P0.01，與模型組比較*P0.05。    4  討論    心肌缺血、缺氧多見于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。?，主要由冠脈分支部分或完全阻塞引起，屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“胸痹”、“心痛”范疇。中醫(yī)認(rèn)為其病位在心，與脾(胃)、腎、肝(膽)等多臟腑相關(guān)，呈現(xiàn)本虛標(biāo)實(shí)的病理特征。本虛責(zé)之于氣、血、陰、陽，標(biāo)實(shí)主要涉及氣滯、血瘀、痰飲、寒凝、火熱等病理產(chǎn)物或因素。本虛又以心氣不足最為突出，標(biāo)實(shí)則以心絡(luò)瘀阻為主。心主血脈，氣為血帥、血為氣母，心氣虛則無力推動(dòng)血液運(yùn)行，以致血行緩慢、終成瘀血。氣行則水行，氣滯則

12、津停，水液代謝發(fā)生障礙而成痰飲，痰飲阻滯心脈，又會(huì)加重瘀血的病理變化，所以心絡(luò)瘀阻的病機(jī)貫穿于整個(gè)病程的始終，冠心病的每個(gè)證型或多或少均有血瘀的表現(xiàn)。故氣虛血瘀是冠心病的主要發(fā)病機(jī)制。大量臨床資料也表明，益氣養(yǎng)心，活血通絡(luò)是防治冠心病的基本治法。    參參康心膠囊是基于中醫(yī)學(xué)對(duì)心肌缺血性疾病的上述認(rèn)識(shí)，以名老中醫(yī)的臨床有效驗(yàn)方為基礎(chǔ)，研制成的純中藥制劑，功能益氣養(yǎng)心活血通絡(luò)。該方臨床應(yīng)用多年，對(duì)冠心病、心肌梗死等心肌缺血性疾病有顯著療效。其組方精煉便于藥物成分檢測(cè)和質(zhì)量控制。    心肌缺血可致心肌功能紊亂，伴有嚴(yán)重的心肌細(xì)胞損傷，

13、其損傷機(jī)制一直是心血管領(lǐng)域的重要研究課題。線粒體是一種膜性細(xì)胞器，其重要的生物學(xué)功能是氧化代謝和鈣代謝。近年來隨著心肌缺血損傷機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)自由基的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)增強(qiáng)與心肌缺血損傷的病理改變關(guān)系密切。心肌缺血時(shí)，自由基的生產(chǎn)增多，而自由基清除酶的活性降低，導(dǎo)致體內(nèi)大量自由基堆積，進(jìn)而使生物膜產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能損傷，從而加劇缺血心肌的組織損失及功能障礙4、5。本研究結(jié)果表明：腹腔注射垂體后葉素后線粒體MDA含量明顯增高（p<0.01），參參康心膠囊大、中、小三劑量組線粒體MDA含量均明顯下降，并且有顯著性差異。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，腹腔注射垂體后葉素后模型組

14、心肌細(xì)胞線粒體SOD活力略有增高，這可能是由于注射垂體后葉素后的機(jī)體發(fā)生的應(yīng)激性反應(yīng)而造成的，而參參康心膠囊組SOD活力雖有所增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，參參康心膠囊通過清除MDA，可防止氧自由基對(duì)心肌線粒體的破壞，達(dá)到對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用，其作用途徑可能不在于提高SOD活性，可能作用于其他途徑，有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Wu,JX,Wang YX,Niu RX,Zhou YG,Liang N.Protective effects XMLon the rats with myocardial injury induced by isoprenalineJ.zhongguo

15、Bingli Zazh(Chin J Pathophysiol),2002,18(1):9798.2 Peng SD,Conk PL,Zheng FD.Effect of magnesium fructose-1,6-diphosphate on myocardial lesoin induced by isoproterenoi in tatsJ.Zhonggeo year He Duli Zazhi(Chin,J Pharmcal Taxicold).2000,14(4):300304.3 趙明奇通心絡(luò)改善缺血心肌供血的NO機(jī)制研究J中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2003，9（6）：43454 Lafont A,Mar