Ames試驗和umu試驗

1、.Ames試驗1基本介紹Ames試驗全稱污染物致突變性檢測。污染物對人體得潛在危害，引起人們得普遍關(guān)注。世界上已發(fā)展了百余種短期快速測試法，檢測污染物得遺傳毒性效應(yīng)。B. N. Ames等經(jīng)十余年努力，于 1975年建立并不斷發(fā)展完善得沙門氏菌回復(fù)突變試驗（亦稱Ames試驗）已被世界各國廣為采用。該法比較快速、 簡便、敏感、經(jīng)濟(jì)，且適用于測試混合物，反映多種污染物得綜合效應(yīng)。眾多學(xué)者有得用 Ames試驗檢測食品添加劑、化妝品等得致突變性，由此推測其致癌性；有得用Ames試驗檢測水源水與飲用水得致突變性（比如，美國派斯凈水器就通過了Ames試驗），探索較現(xiàn)行方法更加衛(wèi)生安全得消毒措施；或檢測城市

2、污水與工業(yè)廢水得致突變性，結(jié)合化學(xué)分析，追蹤污染源，為研究防治對策提供依據(jù)；有得檢測土壤、污泥、工業(yè)廢渣堆肥、廢物灰燼得致 突變性，以防止維系生命得土壤受致突變物污染后，通過農(nóng)作物危害人類；檢測氣態(tài)污染物得致突變性，防止污染物經(jīng)由大氣，通過呼吸對人體發(fā)生潛在危害；用Ames試驗研究化合物結(jié)構(gòu)與致變性得關(guān)系， 為合成對環(huán)境無潛在危害得新化合物提供理論依據(jù)；檢測農(nóng)藥在微Ames試生物降解前后得致突變性，了解農(nóng)藥在施用后代謝過程中對人類有無隱患；還有用 驗篩選抗突變物，研究開發(fā)新得抗癌藥等等。2、目得與原理鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium ）得組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his ）

3、菌株，在 含微量組氨酸得培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變得細(xì)胞外，一般只能分裂幾次， 形成在顯微鏡下才能見到得微菌落。受誘變劑作用后，大量細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見得菌落。 某些化學(xué)物質(zhì)需經(jīng)代謝活化才有致變作用，在測試系統(tǒng)中加入哺乳動物微粒體酶，可彌補(bǔ)體外試驗缺乏代謝活化系統(tǒng)之不足。鑒于化學(xué)物質(zhì)得致突變作用與致癌作用之間密切相關(guān)，故此法現(xiàn)廣泛應(yīng)用于致癌物得篩選。實驗用菌株得細(xì)胞壁還有能使實驗物易于滲透得突變。為了進(jìn)一步增加試驗得敏感性，這些菌株得切除修復(fù) DNA得能力就是缺陷得，并且還有提高錯誤傾向得 DNA修復(fù)得質(zhì)?；?。3、步驟與方法Ames試驗得常規(guī)方法有斑點試驗與平

4、板摻入試驗。1. 菌株鑒定 用于測試得菌株，需經(jīng)基因型與生物學(xué)性狀鑒定，符合要求才能投入使 用。目前推薦使用得一套菌株就是TA97、TA98 TA100與TA102。鑒定前先進(jìn)行增菌培養(yǎng)。為鑒定結(jié)果可靠，需同時培養(yǎng)野生型TV菌株，作為測試菌基因型之對照。增菌培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接種后于37C, 100r/min振蕩培養(yǎng)12h左右，細(xì)菌生長相為對數(shù)期末，含菌數(shù)應(yīng)為 1 X 109個/ml2X 109個/ml。鑒定項目：（1）脂多糖屏障丟失（rfa ）用接種環(huán)或一端撓起得接種針以無菌操作術(shù)取各菌株得增菌培養(yǎng)液，在營養(yǎng)瓊脂平板上分別劃平行線， 然后用滅菌尖頭鑷夾取滅菌濾紙條， 浸濕結(jié) 晶紫

5、溶液，貼放在平板上與各接種平行線垂直相交。蓋好皿蓋后倒置于37t溫箱，培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。(2) R因子 劃線接種，貼放濾紙條及培養(yǎng)等均同上，唯濾紙條浸濕得藥液不同，為氨芐青霉素鈉溶液。TA102除PKM101外，還有pAQ1載有抗四環(huán)素得基因，故另用濾紙條浸濕四環(huán)素溶液后貼放于劃線接種得平板上。(3) 紫外線損傷修復(fù)缺陷( uvrB )在營養(yǎng)瓊脂平板上按上述方法劃線接種后，一半接種線用黑玻璃遮蓋，另一半暴露于紫外光下8sec,然后蓋好皿蓋并用黑紙包裹平皿，防止可見光修復(fù)作用。培養(yǎng)同上。(4) 自發(fā)回變 預(yù)先制備底平板；向滅菌并在水浴內(nèi)保溫 45C得上層軟瓊脂中注入 0、 1ml菌液；混勻后

6、傾于底平板上并鋪平。平皿倒置于37C溫箱培養(yǎng)48h。(5 )回變特性一一診斷性試驗上層軟瓊脂中除菌液外，還注入已知陽性物之溶液，需活化系統(tǒng)者并加入 S9mix，余同上。組氨酸營養(yǎng)缺陷型由自發(fā)回變即可知。2. 斑點試驗吸取測試菌增菌培養(yǎng)后得菌液0、1ml，注入融化并保溫 45 C左右得上層軟瓊脂中，需 S9活化得再加0、3ml 0、4mlS9mix，立即混勻，傾于底平板上，鋪平冷凝。用滅菌尖頭鑷夾滅菌圓濾紙片邊緣，紙片浸濕受試物溶液，或直接取固態(tài)受試物，貼放于上層培養(yǎng)基得表面。同時做溶劑對照與陽性對照，分別貼放于平板上相應(yīng)位置。平皿倒置 于37C溫箱培養(yǎng)48h。在紙片外圍長出密集菌落圈，為陽性；

7、菌落散布，密度與自發(fā)回變相似，為陰性。3. 平板摻入試驗 將一定量樣液與0、1ml測試菌液均加入上層軟瓊脂中，需代謝活化 得再加0、3ml 0、4ml S9mix，混勻后迅速傾于底平板上鋪平冷凝。同時做陰性與陽性對培養(yǎng)同上。同一劑量各皿回MR。MR值2,且有劑量則判為致突變陽性。照，每種處理做3個平行。試樣通常設(shè) 4個5個劑量。選擇劑量范圍開始應(yīng)大些，有陽性 或可疑陽性結(jié)果時， 再在較窄得劑量范圍內(nèi)確定劑量反應(yīng)關(guān)系。 變菌落均數(shù)與各陰性對照皿自發(fā)回變菌落均數(shù)之比，為致變比( -反應(yīng)關(guān)系，背景正常，二.Umu試驗1原理復(fù)制受抑制情況下，細(xì)胞產(chǎn)生一種易錯修復(fù)此時細(xì)胞表現(xiàn)為 DNA修復(fù)功能增強(qiáng)、細(xì)胞

8、生長正常但分裂受抑制基 、單鏈或缺口雙鏈DNA(error- prone re-p air)當(dāng)DNA大范圍受損， 能，稱為SOS修復(fù)， 因突變增加、呼吸受阻等，而細(xì)胞受理化因素?fù)p傷產(chǎn)生得寡核苷酸等成為誘導(dǎo)信號，使無活性得Re-cA蛋白被激活，激活得RecA蛋白可與單鏈 DNA(ssDNA) 結(jié)合形成RecA ssDNA核蛋白體，后者介導(dǎo)LexA蛋白裂解，LexA 蛋白水平得下降可誘導(dǎo) SOS調(diào)節(jié)子，大量轉(zhuǎn)錄recA 基因，同時也激活原被LexA 蛋白阻遏得 SOS相關(guān)基因umuC、umuD等。以上得一系列反應(yīng)為SOS反應(yīng)。SOSUmu測試系統(tǒng)正就是基于 DNA損傷物誘導(dǎo)SOS反應(yīng)而表達(dá)umuC

9、基因得能力，在鼠傷寒沙門菌 Salm on ella typ hi-muriumTA 1535中導(dǎo)入攜帶umuC' Lac Z嵌合體得質(zhì)粒 pSK 1002,該質(zhì)粒攜帶umu操縱子、umuD 基因與umuC Lac Z融合基因得啟動子及四環(huán)素與氯霉素耐藥基因，允許通過藥物選擇轉(zhuǎn)化株，新構(gòu)建得細(xì)菌稱為 S、typhi-murium TA 1535 pSK 1002 。當(dāng)細(xì)菌受誘變物作用引起 SOS反應(yīng)時，激活umuC' Lac Z融合基因，表達(dá)出有B -半乳糖苷酶活性得融合蛋白，通過 檢此酶得活性可以確定受試物引起DNA損傷得程度，若加入S9混合液，則可以檢測化學(xué)物就是否經(jīng)代謝活

10、化生成損害DNA得產(chǎn)物。22、2、試驗菌株1 S 、 typhimurium TA 1535 pSK 1002就是 umu 試驗得最初測試株 ,其構(gòu)建如前所述 , 它也就是構(gòu)建其它測試株得基礎(chǔ) 。2 S 、 typhimurium NM2009氨基偶氮染料與芳香胺能被 P450 乙酰轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)活化成有活性得代謝產(chǎn)物 , 因而將 構(gòu)建得含有 O-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因得質(zhì)粒 PNM12導(dǎo)入S、typhimurium TA 1535 pSK 1002 菌 株從而形成 S 、 typhimurium NM2009, 可以加強(qiáng)檢測這類化學(xué)物得敏感性。2、 3 S 、typhimurium NM3009許多硝基

11、芳烴類物質(zhì)只有被硝基還原酶 O- 乙酰轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)代謝激活后才有活性, 為構(gòu)建對此類化學(xué)物高度敏感得細(xì)菌株，將構(gòu)建得含有硝基還原酶及0-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因得質(zhì)粒PNM13導(dǎo)入原始 S、typhimurium TA1535 pSK 1002, 即成 S、typhimuriumNM3009。2、 4 S 、typhimurium NM5004將含有大鼠 GST 5-5 cDNA 與 umu 操縱子得質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)菌 S 、 typhimurium TA1535。 S 、 typhimurium NM5004 得 GST 活性比 S 、 typhimurium TA 1535 pSK 1002 高 52

12、倍, 因而檢測那些經(jīng) GST 代謝活化或失活得環(huán)境化學(xué)物非常有效。3 操作過程細(xì)菌貯存 :細(xì)菌株可由 0da 博士提供 （日本大阪府立公共衛(wèi)生研究所 ）。將少量細(xì)菌置于 含25mg L氨芐青霉素與10mg L氯霉素得LB培養(yǎng)基中，劇烈振蕩37 C孵育過夜。加30% 甘油或10%二甲亞砜（V/V）,孵育體系分為幾份于 23ml管中，以液氮或干冰-丙酮快 速冷凍，保存于-80 C。細(xì)菌生長：將少量冷凍細(xì)菌放入含氨芐青霉素及氯霉素得LB培養(yǎng)基,37 C振蕩孵育過夜。次日上午 ， 以新鮮 TGA 培養(yǎng)基 20 倍稀釋培養(yǎng)液 ， 繼續(xù)孵育至菌液光密度在 600nm 時 OD直達(dá)0、250、3,試驗前置于

13、冰上。溶于DMSO或水中得受試物（受試化學(xué)物濃度一般, 濃度可提高到 0 、 1mmol/L）, 2ml 上述細(xì)菌懸4）或含有40卩I S9得S9混合液（G6PD NADP+孵育混合體 （終體積 2 、 5ml）：0 、 1ml 大約為 0 、 01mmol/L , 當(dāng)測試弱得誘變物時 液,0 、 4ml 0、 1mol/L 磷酸鹽緩沖液 （pH7、及G6PD脫氫酶等）。37C振蕩孵育2h,將管放在冰上終止反應(yīng)。評價B -半乳糖苷酶活性：（1）將0、2ml上述混合體系轉(zhuǎn)移至新管中。（2）依次加1、8mlZ-緩 沖液（含 60mmoI/L Na 2 HPO4 , 40mmol LNaH 2 PO

14、 4 ,10mmoI/L KCI ,1mmoI/L MgSO 4 , 用前加0、35ml終濃度為50卩moI/L得硫基乙醇到100mI緩沖液中，此緩沖液不需高壓滅 菌）,0、05ml 0、1%十二烷基磺酸鈉（SDS）（W /V）,5卩I氯仿。以攪拌器劇烈混合以裂解細(xì) 菌。（3）與0、10ml鄰硝基苯半乳糖苷溶液（4、0g/L）混合，28C或37 C孵育15min。（4） 加 1mI 得 1moI/L 碳酸鈉終止反應(yīng) 。 （5） 在 420nm 與 550nm 測量吸光度。細(xì)菌生長試驗 ： 以上述剩余得孵育體系在 A600 測量可知細(xì)菌得生長 。結(jié)果評價：酶活性單位（units ml-1 ）=

15、1000X （OD 420 -1、75X OD550 ） （t x v x OD 600 ）, 其中 t 為孵育時間 , 這里指 15min,v 代表轉(zhuǎn)入新管中得混合體系得體積 , 這里指 0 、 2ml44、。如酶活性較對照組大于一倍或以上即可認(rèn)為就是陽性結(jié)果。應(yīng)用1 遺傳毒理學(xué)Reifferscheid 比較了 274 種化合物分別以 umu 試驗及 Ames 試驗檢測得結(jié)果 , 發(fā)現(xiàn)在檢測化合物遺傳毒性方面兩者大約有90%得一致性 , 雖然用 Ames 試驗 （至少用 5 個細(xì)菌株）可以檢測出 97%得 umu 試驗陽性物 （154 種）, 而 umu 試驗只能檢測出 86%得 Ames

16、 陽 性物 （173 種）, 但其余得 14 % 中只有 6 種為致癌物 ;Reifferscheid 還分析了 149 種致癌物與 25 種非致癌物以 umu 試驗檢測得結(jié)果 , 發(fā)現(xiàn)該試驗假陰性率與假陽性率分別為 36%與 28%,但其陽性預(yù)測值高達(dá) 93%。umu試驗同Ames試驗敏感性相似，而新建立起得幾 個測試株對檢測芳香胺與硝基芳烴類化學(xué)物得敏感性大大提高; 而且它還可檢測在標(biāo)準(zhǔn)試驗具有簡單 、快速、敏感、廉價等特點。目前已廣泛應(yīng)用于各類化 , 如各種金屬鹽類 、單個化學(xué)物及復(fù)雜得環(huán)境混合物。如結(jié)合適當(dāng)?shù)?試驗可用于原位檢測職業(yè)場所得遺傳毒物。Ames 試驗中細(xì)胞毒性較大得化學(xué)物 ;umu 試驗周期短 （ 幾小時 ）, 因而對細(xì)菌污染不敏感。在 SOS 基因中 umu 基因與突變得發(fā)生密切相關(guān) , 同 SOS 顯色試驗相比 , 其更能忠實地反映化 學(xué)物得誘變性。綜上所述 , umu學(xué)物得遺傳毒性檢測 空氣采集裝置 , umu4、2 酶代動力學(xué)分析大量前致癌物必須通過微粒體 P450 酶代謝活化才具有生物活性 , 利用 umu 測試系統(tǒng) 對研究生物活化得機(jī)制很有價值 , 通過特定得抗體與化學(xué)修飾物可闡明酶