齊墩果酸對(duì)人早幼粒白血病NB4細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制

1、齊墩果酸對(duì)人早幼粒白血病NB4細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制        【摘要】     目的 探討齊墩果酸對(duì)NB4細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。方法 40、60、80和100 mol/L的齊墩果酸分別處理體外培養(yǎng)的人早幼粒白血病NB4細(xì)胞24、48和72 h后，MTT比色法檢測(cè)NB4細(xì)胞活力;實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析凋亡相關(guān)基因Bcl-2及Bax mRNA的表達(dá)。結(jié)果 齊墩果酸在體外具有明顯的細(xì)胞毒性，可抑制NB4細(xì)胞增殖，且呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性;實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證

2、明，NB4細(xì)胞經(jīng)齊墩果酸處理后，促凋亡基因Bax表達(dá)上調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 齊墩果酸在體外能抑制NB4細(xì)胞增殖，并使促凋亡基因Bax表達(dá)升高，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)降低，上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。     【關(guān)鍵詞】  齊墩果酸;NB4;Bcl-2;Bax    白血病的治療一直以化療為主，大多數(shù)化療藥物都通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)達(dá)到消滅腫瘤細(xì)胞的目的，但是化療藥物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞的毒性作用也不容忽視。此外，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐

3、藥，也使化療的療效大大降低，甚至導(dǎo)致化療失敗。因此，從天然藥物中尋找既可提高治療效果又能減少對(duì)機(jī)體副作用的抗腫瘤活性成分，是當(dāng)今抗腫瘤藥物發(fā)展的主要方向之一。齊墩果酸(oleanolic acid，OA)是一種天然來(lái)源的藥物，廣泛存在于植物中，以游離或結(jié)合成苷的形式存在。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)OA可以通過(guò)多種機(jī)制抑制肝癌、結(jié)腸癌、肺癌和順鉑耐藥胃癌細(xì)胞增殖15，但是OA對(duì)體外培養(yǎng)的人早幼粒白血病(M3型)NB4細(xì)胞的作用未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以M3型白血病NB4細(xì)胞為研究對(duì)象，以不同劑量的OA處理，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響及其對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2及Bax基因表達(dá)的影響，以探討OA抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制。1

4、材料與方法1.1 材料M3型白血病細(xì)胞株NB4(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù));OA(中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)檢定所)。OA用二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成80 mmol/L的原液，-20儲(chǔ)存;用含10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液。RPMI-1640和小牛血清(Gibco);SYBR ExScriptTM RT-PCR kit (Perfect Real Time，TaKaRa公司)。1.2 NB4細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，用滅菌的5.6% NaHCO3溶液將培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.2，每100 ml培養(yǎng)基含青霉素1萬(wàn)U,鏈霉素10 mg、小牛血清10

5、ml。細(xì)胞置于CO2孵箱，37、5% CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)。為避免由于細(xì)胞密度過(guò)大而給細(xì)胞生長(zhǎng)和生存帶來(lái)的可能的影響，每天通過(guò)增加新鮮的培養(yǎng)基來(lái)調(diào)整細(xì)胞密度，使細(xì)胞密度不超過(guò)5×105個(gè)/ml。1.3 OA對(duì)NB4細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB4細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 ml的離心管中，1 000 r/min離心10 min，用新鮮的含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液后，將細(xì)胞接種于3塊96孔培養(yǎng)板。每孔加細(xì)胞懸液200 l (1×104個(gè)細(xì)胞)，然后加入OA，使其終濃度分別為40、60、80和100 m

6、ol/L，每毫升細(xì)胞培養(yǎng)液中DMSO不超過(guò)50 l。每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)平行孔，調(diào)零孔不加NB4細(xì)胞懸液，只加含10%小牛血清的RPMI-1640。細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48和72 h。實(shí)驗(yàn)終止前4 h每孔加入5 mg/ml的MTT磷酸鹽緩沖液20 l，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。1 000 r/min離心10 min，棄上清。每孔再加入DMSO 200 l，振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度值。按下面公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR，%)=(1-實(shí)驗(yàn)孔OD570/對(duì)照孔OD570)×100%。1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NB4細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA表

7、達(dá)100 mol/L OA處理細(xì)胞72 h后，用RNAiso Reagent(TaKaRa公司)抽提細(xì)胞總RNA。按RNAiso Reagent操作說(shuō)明書進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的含量、純度及完整性。引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，序列如下：Bcl-2:上游，5-TGA ACC GGC ATC TGC ACA C-3;下游，5-CGT CTT CAG AGA CAG CCA GGA G-3，產(chǎn)物長(zhǎng)度116 bp;Bax：上游，5- AGA CAC CTG AGC TGA CCT TGG AG - 3;下游，5-GTT GAA GTT GCC ATC AGC AAA

8、CA-3，產(chǎn)物長(zhǎng)度197 bp。-actin上游：5-AAG AGA GGC ATC CTG ACC CT-3;下游：5-TAC ATG GCT GGG GTG TTG AA-3，產(chǎn)物長(zhǎng)度218 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在2700型PCR System擴(kuò)增儀上按SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書進(jìn)行cDNA的合成，反應(yīng)參數(shù)為:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)37 15 min，反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)85 5 s。PCR反應(yīng)采用SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time)kit試劑，在ABI7300熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。設(shè)置檢測(cè)文件,

9、反應(yīng)條件:95預(yù)變性10 s;PCR反應(yīng)，95變性5 s，60退火31 s，共40個(gè)循環(huán)。整個(gè)過(guò)程中收集熒光，反應(yīng)結(jié)束后，使用Sequence Detection software version 1.2.3軟件(Applied Biosystems公司) 分析PCR過(guò)程各檢測(cè)樣本的Ct值，Ct值隨模板濃度增大而減少。由融解曲線判斷PCR反應(yīng)的特異性。用2-Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量分析7。分別擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參，每樣本作3個(gè)復(fù)孔，得到兩組Ct平均值。Ct實(shí)驗(yàn)組=Ct實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參，Ct對(duì)照組= Ct對(duì)照組目的基因-Ct對(duì)照組內(nèi)參，Ct=Ct實(shí)驗(yàn)組-Ct對(duì)照組，目的基因的表達(dá)差異以2

10、-Ct表示。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料用x±s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)。2 結(jié) 果2.1 OA對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用見表1。2.2 OA對(duì)NB4細(xì)胞Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的影響表1 OA對(duì)NB4細(xì)胞增殖的影響2.2.1 OA對(duì)NB4細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響B(tài)cl-2基因的擴(kuò)增曲線和融解曲線見圖1和圖2。100 mol/L OA處理NB4細(xì)胞72 h后Bcl-2 mRNA的表達(dá)見表2，與對(duì)照組相比,OA處理組Bcl-2 mRNA表達(dá)下降60%，差異有顯著性(P2.2.2 OA對(duì)NB4細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)的影響B(tài)ax基因的擴(kuò)

11、增曲線和融解曲線見圖3和圖4。100 mol/L OA處理NB4細(xì)胞72 h后Bax mRNA的表達(dá)見表3。與對(duì)照組相比，OA處理組Bax mRNA表達(dá)升高81%，差異有顯著性(P3 討 論本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的OA對(duì)體外培養(yǎng)的人早幼粒白血病NB4細(xì)胞增殖的影響不同。當(dāng)OA的濃度為40 mol/L時(shí)，作用24 h，對(duì)NB4細(xì)胞的增殖并沒(méi)有抑制作用;作用48 h，抑制率僅為4.64%，與對(duì)照組比較差異不顯著;作用72 h，OA對(duì)NB4細(xì)胞增殖抑制率達(dá)13.70%，與對(duì)照組比較有顯著性差異。當(dāng)OA的濃度達(dá)到60 mol/L及以上時(shí)，OA 則以劑量和時(shí)間依賴的方式抑制 NB4細(xì)胞的增殖。半胱氨酸蛋白

12、酶家族(caspases)以瀑布的方式活化后產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用6。細(xì)胞凋亡的外部途徑即死亡受體途徑由腫瘤壞死因子家族啟動(dòng)，當(dāng)caspase-8被募集到死亡受體復(fù)合物時(shí)，該凋亡途徑即被激活。Bcl-2蛋白家族對(duì)細(xì)胞凋亡的線粒體途徑即內(nèi)部途徑起重要的調(diào)節(jié)作用。Bcl-2基因家族成員分為兩類:Bcl-2類為凋亡抑制因子,包括Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w等;Bax類為凋亡促進(jìn)因子,包括Bax、Bak和Box等。當(dāng)?shù)蛲鲆种埔蜃又械腂cl-2和Bcl-xl過(guò)表達(dá)時(shí)，可阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放及caspases的活化，從而抑制凋亡7。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡因子，該分

13、子常常形成自身二聚體，或與Bcl-2/Bcl-xl形成二聚體，游離Bax或Bax同型二聚體水平升高可促進(jìn)凋亡8。Bcl-2已經(jīng)成為藥物抗性機(jī)制研究的主題，因?yàn)锽cl-2能抑制化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡9。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，100 mol/L OA處理NB4細(xì)胞72 h后，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2以及Bax的表達(dá)均發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為抗凋亡的Bcl-2基因表達(dá)下調(diào)，而促凋亡的Bax基因表達(dá)上調(diào)，OA對(duì)NB4細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過(guò)上調(diào)Bax基因的表達(dá)以及下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的;OA可能通過(guò)線粒體途徑而誘導(dǎo)NB4細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究為臨床白血病的化療和天然抗腫瘤藥物的開發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)的依據(jù)

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