電針對海洛因依賴大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

1、電針對海洛因依賴大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響        【摘要】  目的：觀察海洛因依賴大鼠海馬細(xì)胞凋亡情況及電針的干預(yù)作用,為針刺戒毒提供一定的理論依據(jù)。方法:SD大鼠24只隨機分為對照組和實驗組；實驗組按劑量逐日遞增原則,每日2次、連續(xù)9天皮下注射海洛因，第10天用納洛酮催促戒斷，建立海洛因依賴模型,再經(jīng)跳臺實驗測試篩選,分為電針組和非電針組,每組8只動物；非電針組繼續(xù)給予海洛因維持劑量，電針組停止給藥，處于戒斷狀態(tài),同時選取“百會”、“大椎”進(jìn)行電針，每天1次，連續(xù)7天；采用TUNEL法、Envi

2、sion免疫組化法檢測3組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的變化。結(jié)果:與對照組比較,非電針組大鼠海馬細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.01),Bax蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；與非電針組比較,電針組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)增加(P<0.01),Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。結(jié)論：電針促進(jìn)Bcl-2表達(dá)、抑制Bax表達(dá)，可加速細(xì)胞修復(fù)、保護(hù)損傷腦組織、改善海洛因依賴大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。 【關(guān)鍵詞】  海洛因依賴；細(xì)胞凋亡；海馬；電針The Ef

3、fect of Electroacupuncture on Apoptosis of Hippocampal Neurocyte in Heroin-addict RatsPAN  Li，PAN  Guishu(Department of Cardiology, Baotou Hospital of Tranditional Mongolian and Chinese Medicine, Baotou 014040，China;Department of Physiology, Zunyi Medical College)    Abstrac

4、t  Objective:To observe the curative effect of electroacupuncture (EA) on apoptosis of hippocampal neurocyte, study its acupuncture treatment mechanism and provide some theoretical proofs for EA abstaining from narcotic. Methods: Twenty-four SD rats were randomly divided into the control group

5、and the experimenting group. Heroin was injected subcutaneously twice a day for 9 days, with the dose increasing daily, in rats of the experimenting group. On the tenth day, the withdrawal signs precipitated by intraperitoned injection of naloxone was performed to establish the heroin-dependent mode

6、l. The qualified rats were divided into the non-electroacupunctured group and the electroacupunctured group through the step-down test. Heroin was injected continuously according to the maintenance dose of non-electroacupunctured group, while the electroacupunctured group was no longer given heroin.

7、 Meanwhile, Baihuiand and Dazhui points were chosen for electroacupunture treatment, once a day, for 7 days. Apoptosis of neurocytes in rats' hippocampus was measured with the method of TUNEL; Expression of Bcl-2 and Bax in neurocytes  was measured with Envision immunohistochemical techniqu

8、e and results were analyzed by Imaging Analyzing System. Results: Compared with the control group, apoptosis index (AI) of neurocytes in hippocampus in non-electroacupunctured group was significantly higher, the expression of Bcl-2 decreased significantly, while the expression of Bax increased signi

9、ficantly. Compared with non-electroacupunctured group, apoptosis index (AI) of neurocytes in electroacupunctured group obviously decreased, the expression of Bcl-2 increased significantly，while the expression of Bax decreased significantlyConclusion: Heroin can induce the apoptosis of hippocampus in

10、 rats by up-regulating the protein expression of Bax and down-regulating the protein expression of Bcl-2；Electroacupuncture can inhibit the apoptosis of hippocampus induced by heroin by up-regulating the protein expression of Bcl-2 and down-regulating the protein expression of Bax. Also, electroacup

11、uncture can obviously improve the ability of learning and memory     Key words  Heroin-dependence；Apoptosis；Hippocampus；Electroacupuncture海洛因為二乙酰嗎啡，海洛因依賴在世界范圍內(nèi)成為一種嚴(yán)重的社會公共衛(wèi)生問題，而其中樞機制則是解決臨床預(yù)防和治療的關(guān)鍵，但至今仍不清楚。腦內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)如皮層和海馬等，參與藥物精神依賴的形成。腦功能成像研究表明，阿片成癮戒斷者通過回憶欣快經(jīng)驗引發(fā)心理渴求時，腦內(nèi)與學(xué)

12、習(xí)記憶有關(guān)的腦區(qū)如前額葉、海馬、杏仁核等代謝活動明顯增強。已有證據(jù)表明,皮質(zhì)和海馬直接參與信息的貯存。目前的研究證實了海洛因依賴致腦損傷中有細(xì)胞凋亡的存在，并且有依據(jù)表明調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡可減輕海洛因依賴腦損傷的程度。本實驗旨在探討細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2和Bax在海洛因依賴大鼠海馬的表達(dá)以及電針對其表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討海洛因依賴的學(xué)習(xí)記憶機制提供理論依據(jù)。1  材料與方法1.1  材料  實驗動物選擇健康SD大鼠24只，雌雄不拘，體重180220g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供（生產(chǎn)許可證號SCXK(渝)20020003）。大鼠分籠飼養(yǎng),自由飲水、進(jìn)食

13、。1.2  試劑與儀器  海洛因(純度61.48%,貴州省公安廳提供),鹽酸納洛酮注射液(湖南益橋制藥有限公司)，原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(German Roche Company),Bcl-2和Bax蛋白免疫組化試劑盒（Bcl-2/N- 19,sc-492；Bax/P-19,sc-7480,美國Santa Cruz公司）；DAB顯色試劑（Sigma公司）。LH-402型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京力普康醫(yī)藥科技公司),石蠟切片機,細(xì)胞圖像分析儀(German Leica Company)。1.3  方法  選擇健康SD大鼠24只,隨機分成對照組和實驗組,對照

14、組8只，實驗組16只。實驗組大鼠參照潘貴書1的方法建立海洛因依賴大鼠模型：按逐日遞增海洛因3mg/kg的原則，首日每次劑量3mg/kg,2次/天（上午9點，下午4點），連續(xù)皮下注射9天，第9天每次劑量達(dá)27mg/kg，第10天腹腔注射5mg/kg納洛酮，誘發(fā)戒斷癥狀并與已建立的海洛因依賴大鼠模型戒斷標(biāo)準(zhǔn)比較，確定模型是否建立成功；對照組按同樣方法注射等量生理鹽水。海洛因依賴模型建模成功后，經(jīng)跳臺實驗測試分為電針組和非電針組,每組8只動物。非電針組繼續(xù)給予海洛因維持量27mg/kg，1次/天，連續(xù)7天。對照組按同樣方法注射等量生理鹽水。電針組根據(jù)針灸學(xué)會實驗針灸研究會制定的動物針灸穴位圖譜2選取

15、百會、大椎穴進(jìn)行電針(HANS)治療，百會穴(頂骨正中,兩耳尖連線中點,向前平刺2mm)用1.5寸毫針刺入深度為0.50.8寸，行提插捻轉(zhuǎn)平補平瀉手法，大椎(背部正中，第七頸椎與第一胸椎之間，直刺3mm)進(jìn)針后，順著經(jīng)脈走向進(jìn)針，不進(jìn)行手法刺激，接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，施以連續(xù)波，波寬0.3ms，頻率2/100Hz，疏密波交替，電壓24伏，強度以大鼠能安靜耐受為度。刺激強度采用1mA、2mA、3mA逐漸遞增法,每10分鐘更替1次,刺激持續(xù)時間為30分鐘。每天1次，連續(xù)治療1周。1.4  各指標(biāo)測定1.4.1  標(biāo)本選取與制備  實驗結(jié)束后,大鼠經(jīng)25%氨基甲酸乙酯(

16、4mL/kg)腹腔注射麻醉，剖開胸腔，左心室近心尖處插入灌流針頭，先以生理鹽水100mL快速沖洗，再用40g/L多聚甲醛(0.1mol/L磷酸鹽緩沖液配制,pH7.4)300mL先快后慢灌注固定，取腦組織入上述固定液固定24小時。對照組大鼠按腦立體定位圖譜3，取包含海馬和皮層的腦組織塊，常規(guī)經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚5m，進(jìn)行HE染色，觀察海馬細(xì)胞的形態(tài)變化。原位TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況；免疫組化Envision法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)；操作按試劑盒說明進(jìn)行。1.4.2  結(jié)果判斷  TUNEL染色：細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)

17、胞，即凋亡細(xì)胞。免疫組化：胞漿或胞核中有棕黃色顆粒者為Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞。圖像分析：每組于40×10高倍鏡下隨機選取不同腦區(qū)的510個視域，用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。以0.201m象素點長，在1.769×104m2測量窗下，測量棕黃色反應(yīng)物信號的積分光密度來分析Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的水平。凋亡細(xì)胞計數(shù)：采用鏡下直接計數(shù)，在40×10倍的光鏡視野下，計數(shù)各組海馬區(qū)的510個視域中凋亡細(xì)胞的個數(shù)占整個視野細(xì)胞總數(shù)的百分比，以平均值為細(xì)胞凋亡發(fā)生率(凋亡指數(shù))。1.5  統(tǒng)計學(xué)方法  采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和

18、兩兩比較。2  結(jié)果2.1  組織形態(tài)學(xué)觀察  對照組大鼠海馬錐體細(xì)胞及顆粒細(xì)胞排列緊密，層次豐富，結(jié)構(gòu)清晰，胞漿豐富；非電針組細(xì)胞排列疏松，層次紊亂，細(xì)胞缺失較多，部分細(xì)胞核濃縮深染，胞漿皺縮；電針組細(xì)胞排列較整齊，結(jié)構(gòu)較清晰,見圖1。圖1  海馬DG區(qū)HE染色 (×400)（略）1A:對照組  1B:非電針組  1C:電針組2.2  海馬細(xì)胞TUNEL染色  TUNEL陽性細(xì)胞胞核呈棕黃色,胞漿不著色,染色質(zhì)呈塊狀凝集或裂解成顆粒狀,使圓形胞核致密深染或見多個細(xì)小顆粒聚集。對照組海馬CA區(qū)、CA3區(qū)、

19、齒狀回（DG區(qū)）可見少量TUNEL陽性細(xì)胞,且著色淺淡；非電針組可見較多陽性細(xì)胞，細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞間隙增大，突起明顯減少,部分有核固縮及染色質(zhì)邊集現(xiàn)象；電針組凋亡細(xì)胞數(shù)目較非電針組減少,核固縮及染色質(zhì)邊集現(xiàn)象少見,見圖2。圖像分析結(jié)果表明,非電針組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)比對照組明顯升高(P<0.01),電針組細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)比非電針組明顯降低(P<0.01),但與對照組比較仍有差異(P<0.05），見表1。 圖2  海馬DG區(qū)TUNEL染色 (×400)（略）2A:對照組  2B:非電針組  2C:電針組表1

20、60; 三組大鼠海馬各亞區(qū)TUNEL染色神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)AI比較（略）*與對照組比較P<0.05；*與對照組比較P<0.01；#與非電針組比較P<0.011           2.3  免疫組織化學(xué)染色  Bcl-2蛋白表達(dá)，陽性產(chǎn)物位于細(xì)胞漿及突起，呈棕黃色，主要見于錐體細(xì)胞，胞核著染呈陰性或輕度著染，兩者之間分界明顯，見圖3和圖4。Bax蛋白表達(dá)，陽性產(chǎn)物位于細(xì)胞核，呈棕黃色，胞漿陰性,見圖5和圖6。圖像分析表明,Bcl-2蛋白在對照組呈高表達(dá),非電針組較對照組

21、表達(dá)明顯降低（P<0.01),電針組較非電針組表達(dá)增高（P<0.01),但與對照組比較仍有差異(P<0.05),見表2。Bax蛋白在對照組呈低表達(dá),非電針組較對照組表達(dá)明顯增高(P<0.01),電針組較非電針組表達(dá)降低(P<0.01),但與對照組比較仍有差異（P<0.05),見表3。3組大鼠海馬DG區(qū)未見Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá),無統(tǒng)計學(xué)差異(P >0.05)。圖3  海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)(IHC×400)（略）3A:對照組  3B:非電針組  3C:電針組圖4  海馬CA3區(qū)Bcl-2

22、蛋白表達(dá)(IHC×400)（略）3D:對照組  3E:非電針組  3F:電針組圖5  海馬CA1區(qū)Bax蛋白表達(dá)(IHC×400)（略）4A:對照組  4B:非電針組  4C:電針組圖6  海馬CA3區(qū)Bax蛋白表達(dá)(IHC×400)（略）4D:對照組  4E:非電針組  4F:電針組表2  三組大鼠海馬Bcl-2蛋白表達(dá)積分光密度值和陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)比較（略）*與對照組比較；P<0.05；*與對照組比較P<0.01；#與非電針組比較P<0.01表3

23、0; 三組大鼠海馬Bax 蛋白表達(dá)積分光密度值和陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)比較（略）*與對照組比較；P <0.05；*與對照組比較P<0.01；#與非電針組比較P <0.013  討論海洛因是我國造成機體依賴性的最主要的阿片類藥物。海洛因依賴是非常嚴(yán)重的社會問題。海洛因依賴是由于大量攝入外源性阿片類化合物,反饋抑制使內(nèi)源性阿片肽減少4-5,體內(nèi)阿片肽系統(tǒng)平衡紊亂,影響一系列神經(jīng)生理功能。     學(xué)習(xí)記憶在藥物成癮中居于重要的中心環(huán)節(jié),藥物成癮是一種特殊的惡性學(xué)習(xí)記憶過程6。在被動性回避條件反射模型上所做的研究發(fā)現(xiàn),預(yù)先給予阿片類藥物可

24、干擾記憶的形成，實驗中給藥會干擾回憶過程，而訓(xùn)練后給藥則干擾記憶的鞏固7。報道,長期吸食海洛因可造成智力減退和記憶損害8。海馬是調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)、記憶功能的一個重要腦組織。越來越多的研究表明海馬在阿片類依賴產(chǎn)生中有重要作用。大鼠海馬形態(tài)學(xué)的檢測表明，在海馬結(jié)構(gòu)中，CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)是三個重要的功能區(qū)。本實驗選取海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細(xì)胞和DG區(qū)顆粒細(xì)胞作為觀察指標(biāo)以判斷海洛因依賴對海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡調(diào)控蛋白表達(dá)的影響以及電針的干預(yù)作用。     細(xì)胞凋亡(apoptosis)一種由基因控制的細(xì)胞自主性死亡，是真核細(xì)胞受到外來的某種信號的刺激，通過

25、自身的遺傳機制，釋放內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激動而發(fā)生的自動化死亡。研究發(fā)現(xiàn):海洛因成癮大鼠腦組織廣泛出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡,而且是海洛因成癮造成腦神經(jīng)元死亡的主要形式9。細(xì)胞凋亡在海洛因成癮機制、損害機制、機制等方面的作用目前研究尚少,但有潛在意義，很值得進(jìn)一步研究。近年來的研究表明,海洛因成癮大鼠腦內(nèi)多部位（前額皮質(zhì)、伏隔核、海馬、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、下丘腦等部位）神經(jīng)元胞體、軸突、樹突都出現(xiàn)變性、壞死、凋亡等超微病理結(jié)構(gòu)改變,而前額皮質(zhì)、伏隔核、海馬、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、下丘腦都屬于海洛因成癮腦內(nèi)“獎賞環(huán)路”上的重要環(huán)節(jié),研究海洛因成癮大鼠腦內(nèi)多部位神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變,旨在為海洛因致癮、損害機制的闡明、戒

26、斷治療等提供依據(jù)10。     細(xì)胞凋亡過程由一系列的基因參與調(diào)控，神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中,調(diào)控凋亡的基因主要是Bcl-2(B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2)。Bcl-2基因家族的成員眾多，但其主要分兩類:抑制凋亡基因，如Bcl-2；促凋亡基因，如Bax。如果Bcl-2蛋白表達(dá)過量，它和Bax蛋白結(jié)合成異源二聚體(Bcl-2-Bax)后，剩余的Bcl-2蛋白相結(jié)合成同源二聚體(Bcl-2-Bcl-2),此時細(xì)胞存活；相反，如果Bax蛋白占主導(dǎo)地位，它在結(jié)合Bcl-2蛋白后，自身形成同源二聚體(Bax-Bax)，此時導(dǎo)致細(xì)胞死亡。    據(jù)

27、報道電針能有效控制海洛因依賴戒斷反應(yīng)11,但電針對海洛因依賴神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡調(diào)控基因表達(dá)的影響目前尚未報道。本實驗采取電針大鼠百會、大椎穴來檢測其對學(xué)習(xí)記憶行為和皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。百會、大椎屬督脈經(jīng)穴，督脈又歸屬于腦，是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴。研究證實,針刺百會可提高人及動物的記憶力12。進(jìn)一步的研究表明,督脈位于身體的中軸線上,可以通過兩側(cè)神經(jīng)司控的特性,促進(jìn)腦功能的代償和重組作用,聯(lián)合刺激百會、大椎兩穴,能減少海馬區(qū)內(nèi)神經(jīng)元損傷而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。本實驗圖像分析發(fā)現(xiàn)，海洛因成癮非電針組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)比對照組明顯升高,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低,Bax蛋白表達(dá)明顯增高；而電針組細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)比非電針組明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)增高,Bax蛋白表達(dá)降低,提示海洛因通過引起B(yǎng)cl-2蛋白表達(dá)下調(diào)和Bax蛋白表達(dá)上調(diào)而促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡,而電針百會、大椎穴通過上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2在蛋白水平上的表達(dá)，下調(diào)凋亡促進(jìn)基因Bax在蛋白水平上的表達(dá),抑制海洛因引起的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡而保護(hù)腦細(xì)胞。海洛因引起海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡可能是其損害學(xué)習(xí)記憶的重要機制之一,推測其很可能作為細(xì)胞凋亡級