己烯雌酚印跡分子聚合物合成及其在殘留分析中的應(yīng)用

1、研究簡報己烯雌酚印跡分子聚合物合成及其在殘留分析中的應(yīng)用馬金余1陳波31姚守拙1劉程21(湖南師范大學(xué)化學(xué)生物學(xué)及中藥分析省部共建教育部重點實驗室,長沙4100812(湖南紐爾科技有限公司,長沙410007摘要以己烯雌酚(D iethylstilbestr ol,DES 為模板分子,2甲基丙烯酸為功能單體,二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑,合成己烯雌酚分子印跡聚合物;以該聚合物為填料制成固相萃取小柱,應(yīng)用于己烯雌酚殘留分析的樣品前處理,并比較了該固相萃取小柱與C 18固相萃取小柱對DES 保留行為的差異。通過選擇不同濃度的甲醇水溶液,己烯雌酚達(dá)到理想的分離純化效果;對加標(biāo)雞肉樣進行了含量測定,回收

2、率可達(dá)95%以上。關(guān)鍵詞分子印跡聚合物,固相萃取,己烯雌酚2004211222收稿;2005204204接受本文系國家“十五”重大科技專項“食品安全關(guān)鍵技術(shù)”基金資助項目(No .2001BA804A391引言固相萃取(s olid 2phase extracti on,SPE 是20世紀(jì)70年代中期出現(xiàn)的一種前處理技術(shù)1。該技術(shù)將分離與富集相結(jié)合,具有操作簡單、負(fù)載量大、回收率高等優(yōu)點,因而受到廣泛應(yīng)用。但是常規(guī)固相萃取填料對目標(biāo)物質(zhì)的富集作用缺乏選擇性。分子印跡聚合物(molecular i m p rinted poly mers,M I Ps (如圖1所示是一種具有固定孔穴大小、形狀及

3、確定排列的功能基團的交聯(lián)聚合物。它對模板分子的立體結(jié)構(gòu)具有選擇性“記憶”功能,可作為分子受體來模擬生物大分子行為,因此被廣泛應(yīng)用于識別富集和分析26。己烯雌酚(D iethylstilbestr ol,DES 化學(xué)名為(E 24,42(1,22二乙基21,22亞乙烯基雙苯酚(如圖1所示,是一種作用較強的人工合成雌激素。它能促進蛋白質(zhì)的合成代謝,提高動物日增重和飼料使用效率。己烯雌酚能引發(fā)癌癥,而且通過體內(nèi)沉積能夠影響胚胎發(fā)育,危害下一代。所以對動物性食品中己烯雌酚的殘留檢測已引起了國內(nèi)外的高度重視79 。圖1己烯雌酚分子印跡過程的示意圖Fig .1Schematic diagra m of m

4、olecularly i m p rinting p r odureA.己烯雌酚(diethylstilbestr ol,DES 。本實驗將分子印跡技術(shù)與固相萃取技術(shù)相結(jié)合,制備DES 分子印跡聚合物(DES 2M I Ps 作為固相萃取填料,應(yīng)用于DES 的殘留分析,取得較好的結(jié)果。2實驗部分2.1儀器與試劑Shi m adzu 10A LC 2class VP 系統(tǒng)(日本島津公司,含LC 210ADVP 泵、SP D 210AVP 紫外檢測器、SI L 2第33卷2005年10月分析化學(xué)(FE NX I HUAXUE 研究簡報Chinese Journal of Analytical Ch

5、e m istry 第10期1413141610ADVP 自動進樣器、CT010AVP 柱溫箱;JCX 2250W 型超聲波清洗器(山東濟寧超聲電子儀器廠;SHB 2型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司;GSY 2型不銹鋼電熱恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)療儀器廠;Z B 282B 型真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠;G L 220B 冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠。己烯雌酚(99%,中國藥品生物制品檢定所;甲醇色譜純,雙酚A 、酚酞分析純、甲基丙烯酸化學(xué)純、二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二異丁腈均為化學(xué)純,雙蒸去離子水。2.2色譜條件色譜柱為Shi m adzu C 18(5m ,150mm 

6、15;4.6mm i .d .日本島津公司;流動相為甲醇/水(7030,V /V ,流速1.0mL /m in;柱溫30;檢測波長254nm 。2.3實驗方法3結(jié)果與討論3.1定量標(biāo)準(zhǔn)曲線按所配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度進行液相色譜測定。以己烯雌酚的色譜峰面積(Y 和濃度(C :mg/L 做線性回歸,得到的線性方程為Y =8.965C -0.354,在0.0520.0mg/L 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)大于0.9996。3.2比較C 18與D ES 2M I Ps 固相萃取小柱對D ES 保留行為取4.0、6.0mg/L 己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液各10mL 分別平行過C 18固相萃取小柱和DE

7、S 2M I Ps 固相萃取小柱(上樣量分別為40.0、60.0g ,依次用20mL 30%、40%、50%和60%甲醇水溶液洗脫,洗脫液分別進HP LC 測定。由表1可知,對過C 18萃取小柱的洗脫液進行分析發(fā)現(xiàn):40%的甲醇水溶液能夠洗脫出少量DES;繼續(xù)用50%的甲醇水溶液能夠洗脫出大部分的DES;再用60%的甲醇水溶液時,仍有少量殘余的DES 被洗脫。用濃度為40%、50%及60%的甲醇水溶液依次清洗DES 2M I Ps 固相萃取小柱,洗脫液中未能檢測到DES;當(dāng)用濃度為70%甲醇水溶液清洗DES 2M I Ps 固相萃取小柱,能有效地洗脫出富集在小柱的DES,由此可知DES 2M

8、I Ps 固相萃取小柱對目標(biāo)物DES 有較好的富集分離效果。結(jié)果見圖2(a 。表1C 18與DES 2M I Ps 固相萃取小柱對DES 保留行為的差異比較Table 1The comparis on of retenti on behavi or of DES bet w een C 18and DES 2moleculary i m p rinted poly mers (M I Ps s olid 2phase extracti on cartridge柱型Style of cartridge上樣量Mass of l oad (g 上樣過柱液Residue s oluti on (g 不

9、同濃度的甲醇洗脫液中檢測DES 量The mass of DES in the eluti on s oluti on (g 30%40%50%60%70%80%C 184141分析化學(xué)第33卷由于C18、DES2M I Ps都是疏水性吸附劑,在較低濃度的甲醇水溶液中,DES與C18、DES2M I Ps 之間有圖2不同甲醇濃度洗脫液的HP LC檢測譜圖Fig.2Chr omat ogram of DES eluted by differentconcentrati on of methanola.DES2M I Ps小柱加載DES標(biāo)樣(standard s oluti on ofDES l

10、oad int o DES2M I Ps cartridge;b.DES2M I Ps小柱加載混合標(biāo)樣(m ixed standards s oluti on l oad int o DES2M I Ps cartridge;c.DES2M I Ps小柱加載加標(biāo)雞肉樣提取液(extracti on s oluti on fr om s p iked chicken sa mp lel oad int o DES2M I Ps cartridge。1.上柱液(s oluti on byl oading; 2.過柱后的溶液(residue s oluti on;3,4,5,6,7.分別為40%、5

11、0%、60%、70%、80%甲醇洗脫液(the eluting s oluti on by aqueous s oluti on including40%,50%,60%,70%,80%methanol,res pectively,色譜條件見實驗部分(HP LC conditi onsas described in the experi m ental secti on。A.酚酞(phenol phthalien,B.雙酚A(bis phenol A;C.己烯雌酚(diethylstilbestr ol。很強的疏水作用,使得DES在C18、DES2M I Ps上都有很強的吸附。因此30%甲醇水

12、溶液不能洗脫DES;但隨著甲醇含量由40%升到60%,逐漸破壞了DES與C18之間的疏水作用,使得DES逐步被洗脫出來;而DES2M I Ps與DES之間具有雙重分子間作用力,即疏水性作用和印跡作用,由于在甲醇濃度由40%提升到60%的過程中,逐漸破壞了DES與DES2M I Ps之間的疏水作用,但不足以破壞印跡作用,故與DES2M I Ps結(jié)合的DES不能被洗脫。但當(dāng)甲醇含量達(dá)到70%時,會破壞DES2M I Ps與DES之間的印跡作用。同時由于DES2M I Ps對DES印跡作用的選擇性、專屬性使得在此條件下DES能完全被洗脫。3.3抗干擾性實驗選擇與己烯雌酚結(jié)構(gòu)相似且含雙酚功能基團的雙酚

13、A和酚酞考察DES2M I Ps小柱對DES選擇性保留。結(jié)果如圖2(b所示,DES2M I Ps小柱對DES具有顯著的選擇性保留。3.4回收率測定為驗證70%甲醇水溶液作為洗脫液的可靠性以及考察DES2M I Ps柱是否能重復(fù)使用,用含40g和60g的DES標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液分別上樣3次,測定其回收率。由實驗可知DES2M I Ps小柱分離富集DES的回收率是97.6%和98.2%;RS D均小于1.3%,并且小柱活化后能重復(fù)使用。3.5加標(biāo)肉樣的測定從市場購買新鮮雞肉500g并絞碎,稱取樣品3份各1510g,分別加入3個100mL的容量瓶,依次加入4mL濃度為0.3、0.5、018g/質(zhì)L的己烯雌

14、酚標(biāo)樣,混合均勻。加甲醇96mL,超聲30m in,10000r/m in離心,得上清液。取上清液30mL置于100mL容量瓶,用雙蒸水定容到100mL,得工作液。雞肉空白樣品的處理除不加入己烯雌酚標(biāo)樣外,其余步驟相同。分別取10mL過DES2M I Ps固相萃取小柱,然后依次用20mL含甲醇40%、50%、60%、70%及80%的水溶液洗脫,洗脫液中DES通過HP LC測定。結(jié)果如圖2(c所示,運用DES2M I Ps固相萃取小柱能較好地排除提取液中雜質(zhì)的干擾。由表2可知,DES2M I Ps小柱分離富集提取液中DES的回收率大于95%;RS D 小于210%,同時可知甲醇提取肉樣中的DES

15、的回收率在98.7%99.6%之間。結(jié)果表明,DES2M I Ps 固相萃取技術(shù)是DES殘留分析的實用的前處理方法。表2回收率及精密度(n=3Table2Recoveries and p recisi on(n=3雞樣Chicken samp le 加入量Added(mg提取回收率Extracti on recovery(%上樣量Loaded(g固相萃取回收率SPE Recovery(%相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RS D(%空白B lank未檢出(not detected加標(biāo)References1Zhang Haixia(張海霞,Zhu Pengling(朱彭齡.Chinese J.A nal.Che m.

16、(分析化學(xué),2000,28(9:117211805141第10期馬金余等:己烯雌酚印跡分子聚合物合成及其在殘留分析中的應(yīng)用6141分析化學(xué)第33卷2J iang Zhongyi(姜忠義.Che m istry W orld(化學(xué)世界,2003,(2:1051083Shi Ruixue(史瑞雪,Guo Chenghai(郭成海,Zou Xiaohong(鄒小紅,Zhu Chunye(朱春野,Zuo Yanjun(左言軍, Deng Yundu(鄧云度.Progress in Che m istry(化學(xué)進展,2002,14(3:1821917Pan Zuting(潘祖亭,Yao L ifeng(

17、姚禮峰,M a Hongyan(馬紅燕.Journal of W uhan U niversity(N atural Science Edition (武漢大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版,1997,43(6:701705Syn thesis of D i ethylstilbestrol2ba sed M olecul arly I m pr i n tedPoly m ers and Its Appli ca ti on i n Resi dues Ana lysisMa J inyu1,Chen Bo31,Yao Shouzhuo1,L iu Cheng21(Key L aboratory of C

18、he m ical B iology T raditional Chinese M edicine R esearch,M inistry of Education,Hunan N or m al U niversity,Changsha4100812(Hunan N iuer Technology Co.,L TD Changsha410007AbstractU sing diethylstilbestr ol(DESas te mp late molecule,2methacrylic acid(MAAas functi onal monomer,and ethylene di m eth

19、acrylate(E DMAas cr osslinking agent,a poly mer was synthesized by molecu2 lar i m p rinting technique.The molecularly i m p rinted poly mers(M I Pswere l oaded int o the s olid2phase extracti on(SPEcartridge,which was app lied t o the p retreat m ent of residues analysis of diethylstilbestr ol. Eluti on conditi ons of DES on the s olid2phase extracti on cartridge were op ti m ized.Further more,the difference of the retenti on characteristics of diethylstilb