復(fù)方中藥丹星通絡(luò)湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用(一)

1、復(fù)方中藥丹星通絡(luò)湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用(一)【關(guān)鍵詞】 復(fù)方丹星通絡(luò)湯；腦缺血;再灌注損傷;乳酸脫氫酶；FAS【Abstract】 AIM: To study the neuroprotection and mechanism of danxingtongluotang （DX） on rats with focal cerebral ischemiareperfusion (I/R) injury. METHODS: Forty SD male rats were divided randomly into 4 groups: control group, shamoper

2、ated + normal saline (NS); model group, cerebral I/R+NS; nimodipine group, I/R+nimodipine; DX group, I/R+DX. The 4 groups were fed with NS, nimodipine or DX for consecutive 5 d. Focal I/R models were made with sutureocclusion method. After cerebral ischemia for 2 h and then reperfusion for 24 h, the

3、 activity of LDH in serum was measured and the expression of FAS in brain tissue was detected. RESULTS: After cerebral I/R, the activity of LDH in serum of model group increased significantly as compared with control group (P0.05); the activity of LDH in nimodipine group and DX group decreased obvio

4、usly and was lower than that in model group （P0.05, P0.01）, there was no significant difference between the activity of nimodipine group and DX group (P0.05). Expression of FAS in brain tissue of model group increased significantly as compared with that in control, nimodipine and DX groups (P0.01);

5、the expression of FAS in brain tissue of nimodipine and DX groups was decreased significantly as compared with that in model group（P0.01）; the level of DX group was lower than that of nimodipine group. CONCLUSION: DX has an obvious protection against I/R injury probably through decreasing the activi

6、ty of LDH and the expression of FAS in brain tissue.【Keywords】 danxingtongluotang; cerebral ischemia; reperfusion injury; LDH； FAS【摘要】 目的: 探討復(fù)方中藥丹星通絡(luò)湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制. 方法: 40只大鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組(假手術(shù)+生理鹽水)、模型組(缺血再灌注+生理鹽水)、尼莫地平組(缺血再灌注+尼莫地平)、復(fù)方丹星通絡(luò)湯組(缺血再灌注+復(fù)方丹星通絡(luò)湯). 每組分別連續(xù)5 d灌胃口服生理鹽水、尼莫地平、復(fù)方丹星通絡(luò)湯. 線栓法

7、制作局灶性腦缺血再灌注模型，缺血2 h后再灌注24 h. 檢測(cè)血清乳酸脫氫酶（LDH）活力、大腦FAS細(xì)胞表達(dá). 結(jié)果:模型組大鼠局灶性腦缺血再灌注后血清LDH活力明顯高于對(duì)照組（P0.05）, 尼莫地平組、復(fù)方丹星通絡(luò)湯組血清中LDH活力明顯降低（尼莫地平組vs 模型組，P0.01； 復(fù)方丹星通絡(luò)湯組vs模型組，P0.05），尼莫地平組和復(fù)方丹星通絡(luò)湯組間無(wú)顯著性差異（P0.05）. 模型組大腦FAS細(xì)胞表達(dá)明顯高于對(duì)照，尼莫地平，復(fù)方丹星通絡(luò)湯組（P0.01）,與模型組比較，尼莫地平組、復(fù)方丹星通絡(luò)湯組腦組織FAS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)顯著下調(diào)（P0.01）,復(fù)方丹星通絡(luò)湯組明顯低于尼莫地平組（P

8、0.01）. 結(jié)論: 復(fù)方丹星通絡(luò)湯可有效地防止FAS及LDH升高, 對(duì)腦缺血再灌注腦損傷有顯著保護(hù)作用.【關(guān)鍵詞】 復(fù)方丹星通絡(luò)湯；腦缺血;再灌注損傷;乳酸脫氫酶；FAS0引言復(fù)方中藥丹星通絡(luò)湯是在清熱化痰、活血通絡(luò)治療中風(fēng)病的理論基礎(chǔ)上，化裁精簡(jiǎn)的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由丹參、膽南星、三七等藥組成. 我們觀察了該藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠局灶性腦缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用，并初步分析了其作用機(jī)制, 為臨床防治中風(fēng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).1材料和方法1.1材料復(fù)方丹星通絡(luò)湯生藥由大連醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥局代購(gòu)，常規(guī)水煎，濃縮至1 kg/L（生藥量）的溶液備用. 尼莫地平片（山西亞寶藥業(yè)有限公司）；FAS（NEO MAR

9、KERS公司），稀釋度為1150；Sp即用型工作試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);多聚甲醛（天津市化學(xué)試劑廠）. 721分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；802離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)；微量天平：北京賽多利儀器系統(tǒng)有限公司；熒光顯微鏡BX51：日本Olympus；數(shù)碼相機(jī)cool PI995:日本Nikon；超薄切片機(jī)(上海手術(shù)器械廠)；SHZ300多用途水浴恒溫箱（江蘇太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠）. 40 g/L多聚甲醛固定液：900 mL蒸餾水中加入Na2HPO4?12H2O 36 g，多聚甲醛40 g，加熱攪拌（勿使其沸騰）,待其完全溶解后加入Na2HPO4?2H2O 3 g，定容至1

10、000 mL；PBS：900 mL蒸餾水中加入NaCl 9 g，Na2HPO4?12H2O 6 g，Na2HPO4?2H2O 0.4 g，定容至1000 mL；DAB顯色劑：臨用先配. 6 mg DAB粉末加入10 mL PBS，充分研磨后，加入30 mL/L H2O 230 L混勻，避光.1.2方法SD大鼠體質(zhì)量約200250 g，雄性，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. 大鼠40只隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、模型組、尼莫地平組及丹星通絡(luò)湯組. 對(duì)照組和模型組分別灌胃生理鹽水20 mL/kg，尼莫地平組20 mL/kg灌胃（濃度1 g/L），丹星通絡(luò)湯組灌胃復(fù)方丹星通絡(luò)湯7.5 mL/kg. 連續(xù)

11、灌胃5 d，最后灌胃2 h后線栓法造模，用100 mL/L水合氯醛(3 mLkg)腹腔麻醉，取仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上行右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻斷術(shù)(MCAO)，頸部正中切開(kāi)，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈及翼顎動(dòng)脈. 先結(jié)扎翼顎動(dòng)脈的近心端，防止魚(yú)線插入翼顎動(dòng)脈，然后在頸總動(dòng)脈前壁剪一小口，插入魚(yú)線，經(jīng)頸總動(dòng)脈穿入頸內(nèi)動(dòng)脈，繼續(xù)向前推進(jìn)直到感覺(jué)有輕微阻力，提示尼龍線的頭部已經(jīng)達(dá)到了頸內(nèi)動(dòng)脈的分叉處,即大腦中動(dòng)脈的起始部. 頸總動(dòng)脈分叉處切口，插入直徑0.22 mm魚(yú)線，進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，深度為1720 cm，至大腦前動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈所有的血流來(lái)源. 扎緊備線，外留1 cm長(zhǎng)線頭，縫合皮膚.

12、缺血2 h后再灌注，勿需再次麻醉和切開(kāi)皮膚，輕輕提拉所留線頭至阻力時(shí)提示魚(yú)線頭端已至頸總動(dòng)脈切口處，血液再通，再灌注24 h. 再灌前參照Longa等方法進(jìn)行5 分制神經(jīng)功能評(píng)分(0分:無(wú)明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1分:不能完全伸展左前肢；2分:向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分:向左側(cè)傾倒；4分:不能自行行走). 評(píng)分為13分者模型制備成功，余者剔除. 不足預(yù)定數(shù)額者按照隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動(dòng)物并重新造模. 對(duì)照組栓線不插入頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段， 其余同以上.血清中LDH活力的測(cè)定：腦缺血、再灌注模型再灌24 h，腹主動(dòng)脈取血5 mL，高速離心機(jī)離心取上清液2 mL，編號(hào),24冷藏，制備血清標(biāo)本；將備好的血清用分光光度劑測(cè)定測(cè)

13、定管A值、測(cè)空管A值、標(biāo)空管A值、標(biāo)準(zhǔn)管A值，利用公式，計(jì)算血清中LDH活力. 血清中LDH活力=（測(cè)定管A值-測(cè)空管A值）/（標(biāo)準(zhǔn)管A值-標(biāo)空管A值）2000,標(biāo)準(zhǔn)管A值=0.1899, 標(biāo)空管A值=0.085, 測(cè)空管A值=0.12.大鼠腦組織FAS的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分析：將各組大鼠深度麻醉，迅速打開(kāi)胸腔，左心室插管經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注生理鹽水200 mL，再持續(xù)灌注0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的40 g/L多聚甲醛固定液300 mL，斷頭取腦，再用相同固定液后固定1 h，制備腦組織； 石蠟包埋、切片、防脫片處理；分別取與HE染色相鄰的切片進(jìn)行FAS免疫組化檢測(cè)：免疫組化采用SP法，DAB

14、顯色；結(jié)果評(píng)定：用光學(xué)顯微鏡（400），觀察每個(gè)視野中FAS蛋白表達(dá)數(shù)目（胞質(zhì)棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞），每組隨機(jī)數(shù)5個(gè)視野取其均值作為本組的代表值.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xs表示, 運(yùn)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行KruskalWallis檢驗(yàn)，兩組間比較用Wilcoxon秩和檢驗(yàn). 以P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.2結(jié)果2.1血清中LDH活力大鼠模型組血清中LDH活力明顯高于對(duì)照組（P0.05）. 與模型組比較，尼莫地平及丹星通絡(luò)湯組血清中LDH活力明顯降低（P0.01,P0.05），尼莫地平與丹星通絡(luò)湯組血清中LDH活力下降比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05，表1）. 表1局灶性腦缺血再灌注血清中L

15、DH活力, 腦組織FAS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（略）2.2各組大鼠腦組織FAS的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分析由免疫組化切片可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，大鼠模型組、尼莫地平組、丹星通絡(luò)湯組腦組織FAS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)顯著上調(diào)（P0.01）. 與模型組比較，尼莫地平組、丹星通絡(luò)湯組腦組織FAS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)顯著下調(diào)，與模型組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01）,尼莫地平組與丹星通絡(luò)湯組比較，以丹星通絡(luò)湯組差異最為明顯（P0.01，表1，圖1).3討論丹星通絡(luò)湯對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，可能和以下作用機(jī)制有關(guān):3.1缺血再灌注血清乳酸脫氫酶的改變當(dāng)腦缺血引起細(xì)胞損傷后，大量存在于神經(jīng)元細(xì)胞的胞質(zhì)和線粒體中LDH可釋放到細(xì)胞間隙，再

16、擴(kuò)散人腦脊液，通過(guò)受損的血腦屏障進(jìn)入血液1. LDH酶活性、Na+K+ATP酶活性的測(cè)定可作為受損部位能量代謝改變的指標(biāo)，其質(zhì)與量的改變，直接影響到機(jī)體的能量代謝，當(dāng)各組織器官受損時(shí)，可見(jiàn)LDH酶活性增高，Na+K+ATP酶活性受抑制.3.2缺血再灌注腦細(xì)胞FAS的改變?cè)谌毖俟嘧⑸窠?jīng)元死亡中,壞死與凋亡是共存的2,壞死多發(fā)生于急性期,而繼發(fā)性或遲發(fā)性死亡則以凋亡為主.中藥對(duì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的自身修復(fù),預(yù)防神經(jīng)元的損傷,減少處在半暗區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞的死亡是有很大優(yōu)勢(shì)的3-4. 研究5-6表明FAS蛋白在許多因缺血缺氧而致的凋亡組織中均呈陽(yáng)性表達(dá). 當(dāng)細(xì)胞表達(dá)FAS時(shí)，F(xiàn)AS與天然配體FAS或FAS抗體結(jié)

17、合后可向細(xì)胞內(nèi)傳遞死亡信號(hào)， FAS死亡區(qū)發(fā)生交聯(lián),產(chǎn)生神經(jīng)酰胺,通過(guò)某種途徑,激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶,使細(xì)胞核DNA斷裂,引起表達(dá)FAS的靶細(xì)胞在數(shù)小時(shí)內(nèi)凋亡7. 本研究結(jié)果顯示,應(yīng)用尼莫地平、中藥后腦組織FAS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)顯著下調(diào)（P0.01），中藥效果優(yōu)于尼莫地平（P0.01）.祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為中風(fēng)急性期以痰濁和淤血為本. 復(fù)方丹星通絡(luò)湯以丹參、膽南星為主，活血通絡(luò)、清熱化痰8，大黃、黃芩瀉熱毒、導(dǎo)阻滯為輔，白術(shù)澤瀉清熱化痰、健脾燥濕，黃芪防風(fēng)益氣固表，元參葛根補(bǔ)陽(yáng)解肌，槐花、三七、川穹、紅花化瘀通絡(luò)、溫經(jīng)活血，在不同時(shí)期對(duì)中風(fēng)病均有治療作用. 我們發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹星通絡(luò)湯可以明顯降低局灶性腦缺血

18、再灌注動(dòng)物血清中LDH活力，抑制腦組織FAS 蛋白表達(dá), 在腦缺血性疾病的臨床治療中是很有意義和應(yīng)用價(jià)值的.【參考文獻(xiàn)】1 肖麗萍，黃益興急性腦梗塞血清乳酸脫氫酶的測(cè)定及臨床意義J腦與神經(jīng)疾病雜志，2000，8(1)：542 蘭希發(fā)，姚文秀，郭陽(yáng). 腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制J. 中國(guó)臨床康復(fù)，2003,7(19):2726-2727.3 孟祥磊,萬(wàn)海同. 中醫(yī)藥抗腦缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展J. 中國(guó)中醫(yī)急癥,2004,4(13):4.4 張梅,李平. 黃芪、川芎及其配伍對(duì)腦缺血后凋亡相關(guān)基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究J. 中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2002, 8(7):16.5 馮云，孫瑞蘭. 大鼠缺血再灌注后FAS有關(guān)的死亡區(qū)和FAS有關(guān)的磷酸酶在不同部位和不同時(shí)間的表達(dá)J. 中國(guó)臨床康復(fù)