外周血內(nèi)皮祖細胞改善肢體缺血的研究(一)

1、外周血內(nèi)皮祖細胞改善肢體缺血的研究(一)作者：王輝，王嶺，李開宗，凌瑞，孫寶華，李曉軍，易軍 【關鍵詞】 內(nèi)皮；干細胞；移植；外周血【Abstract】 AIM: To estimate the effect of human peripheral blood derivedendothelial progenitor cell(EPC) transplantation on the repairment of limb ischemia. METHODS: The mononuclear cells from human peripheral blood were cultured in M

2、199 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 20 ng/mL VEGF and 4ng/mL bFGF in vitro. The specific markers of EPC were analyzed by FCS at day 6 and 14 during culture respectively. The bilateral femoral artery, great saphenous artery, iliac circumflex artery, and muscular branch of 15 Balb/c n

3、ude mice were ligated to cause limb ischemia. The 6day adherence cells marked by CMDiI were multipoint injected into the left local muscles of ischemic limbs(EPC group) and M199 was multipoint injected into the right local muscles of ischemic limbs (M199 group) in order to eva luate the therapeutic

4、effect. Seven days after operation, 60 g FITCUEA was injected via tail vein.One hour later, the mice were killed.The heart,liver,lung,spleen,kidney and limb gastrocnemius were taken and examined with fluorescence microscopy. The number of capillaries of ischemic limbs was measured by factor related

5、antigen immunohistochemical staining. RESULTS: The cultured cells at day 6 expressed KDR, CD133, CD34 and vWF,and the positive rates of KDR, CD133, CD34 and vWF were (46.49.3)%, (33.811.7)%,(73.56.3)%and (38.98.2)%, respectively. At the 14th day during culture, the cells expressed KDR, CD34 and vWF

6、and the positive rates of KDR,CD34 and vWF were (81.57.6)%,(88.95.4)% and (78.313.6)%, respectively; the positive rate of CD133 dropped to (3.88.7)%. The necrosis and density of capillary of the ischemic limbs of nude mice were improved more obviously in the EPC group than that in the M199 group (P0

7、.05). Red and green fluorescence were observed in the paraffin section of ischemic limbs of nude mice in the EPC group. CONCLUSION: We can culture and obtain EPC from mononuclear cells of human peripheral blood in vitro under a certain condition. The transplanted EPC can incorporate into the local c

8、apillary networks and repair the ischemia of posterior limbs of nude mice.【Keywords】 endothelium; stem cells; transplantation；peripheral blood【摘要】 目的： 研究人外周血來源內(nèi)皮祖細胞(EPC)移植對改善肢體缺血的作用. 方法： 人外周血單個核細胞在體外誘導擴增6 d和14 d后，分別檢測其EPC特異性標志的表達，并將熒光染料標記后的培養(yǎng)第6日的貼壁細胞通過缺血局部多點注射移植到后肢缺血的裸鼠動物模型體內(nèi)，以評價其治療效果. 結果： 人外周血單個核細胞

9、經(jīng)體外誘導分化，培養(yǎng)第6日的貼壁細胞表達KDR, CD133, CD34和vWF，流式細胞儀檢測其陽性率分別為（46.49.3）%, （33.811.7）%, （73.56.3）%和（38.98.2）%；培養(yǎng)第14日的貼壁細胞KDR, CD34和vWF的表達陽性率均增高，而CD133表達陽性率明顯降低，流式細胞儀檢測其陽性率分別為（81.57.6）%, （88.95.4）%, （78.313.6）%和（3.88.7）%；移植EPC后裸鼠缺血后肢的壞死情況和毛細血管密度均較對照組明顯改善(P0.05)；移植EPC后缺血后肢肌肉石蠟切片中可見分散不均的紅色和黃綠色雙色熒光的細胞摻入. 結論： 從人

10、外周血單個核細胞中可誘導出EPC，而且移植的EPC可以定向整合到后肢缺血局部，明顯改善裸鼠后肢缺血.【關鍵詞】內(nèi)皮；干細胞；移植；外周血1997年Asahara等1在 Science雜志發(fā)表論文報道內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPC)分離成功，并在體內(nèi)證明其血管生成的能力. 從此EPC受到了研究者的普遍關注，國內(nèi)外關于EPC的研究方興未艾2-3. 骨髓、外周血和臍血來源的EPC能在體外擴增并分化成功能性內(nèi)皮細胞，在修復心肌梗死患者的心臟，治療臨床肢體缺血、冠狀動脈疾病、腦中風，改善糖尿病患者的血管形成能力，抑制腫瘤血管生成，以及作為基因治療導向載體和

11、靶細胞等方面，具有廣闊的應用前景4-7. 我們擬將人外周血單個核細胞在體外特定生長因子的調(diào)控下誘導分化為EPC，并且通過注射熒光染料標記后的EPC于動物體內(nèi)，觀察其對改善肢體缺血的作用，以期指導臨床實踐.1材料和方法1.1材料100 mL/L胎牛血清（四季青，杭州），20 g/L的VEGF和4 g/L的bFGF（PEPROTECH,英國）；Balb/c無胸腺裸鼠(78 wk, 18.522 g，第四軍醫(yī)大學實驗動物研究中心)；碳花青熒光染料(CMDiI，Molecular Probes，美國)；荊豆凝集素(UEA，VECTOR LABORATORIES，美國)；vWF（博士德，武漢）.1.2方

12、法統(tǒng)計學處理: 計量資料以xs表示，組間統(tǒng)計處理采用配對t檢驗，計數(shù)資料采用Fisher確切概率檢驗分析(n=30). 所有統(tǒng)計分析采用 SPSS11.0軟件完成.2結果2.1人外周血單個核細胞的體外培養(yǎng)和鑒定人外周血單個核細胞在培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)貼壁,從第4日開始出現(xiàn)細胞形態(tài)的改變，由圓形細胞逐漸向兩端伸展呈紡錘形，數(shù)量增多(圖1)，在培養(yǎng)第5日出現(xiàn)大量的梭形細胞,可見部分梭形細胞以細胞團為中心呈放射狀生長. 培養(yǎng)第710日,細胞繼續(xù)增多，可見內(nèi)皮細胞特異性索條狀結構. 到第14日鋪滿瓶底的80%，第6日和第14日細胞計數(shù)分別為(3.750.36)108/L和(1.520.28)108/L.

13、 培養(yǎng)第6日的貼壁細胞表達KDR, CD133, CD34和vWF，流式細胞儀檢測其陽性率分別為(46.49.3)%, (33.811.7)%, (73.56.3)%和(38.98.2)%；培養(yǎng)第14日的貼壁細胞KDR, CD34和vWF的表達陽性率均增高，而CD133表達陽性率顯著降低，流式細胞儀檢測其陽性率分別為(81.57.6)%, (88.95.4)%, (78.313.6)%和(3.88.7)%.圖1培養(yǎng)第4日細胞開始伸展，部分呈梭行2.2EPC移植后的組織分析EPC組缺血后肢肌肉中有分散不均的能激發(fā)出紅色(代表CMDiI)和黃綠色(代表FITCUEA)雙色熒光的細胞摻入(圖2)，說

14、明移植的EPC定向整合到了缺血局部. 其他臟器以及M199對照組后肢，則未見雙色熒光.圖2EPC組后肢肌肉中可見紅色和黃綠色雙色熒光2.3肢體缺血情況的檢測EPC組缺血后肢肌肉中的毛細血管密度高于M199組（6.81.5） vs （3.81.6), P0.05,說明EPC組的血管重建過程增強，EPC的移植極大地改善了缺血肢體的恢復. M199對照組中僅有2條后肢未出現(xiàn)明顯壞死，3條后肢趾端壞死，10只出現(xiàn)小腿的自動脫落；而在EPC組,有10條后肢未見明顯壞死，4條后肢有趾端壞死，僅1條后肢出現(xiàn)肢體脫落. 資料統(tǒng)計中趾端壞死和肢體脫落均視為無效，兩組間有效率比較(13.33%) vs (66.6

15、7%)差異有顯著意義(P0.01).3討論近年來，出生后血液循環(huán)中存在能分化為內(nèi)皮細胞的EPC的概念逐漸得到關注，這種具有高增殖潛能的細胞以出生后血管生成的方式參與缺血局部的血管重建過程8-9. 目前關于EPC的研究取得了很大的進展，但是仍有許多不清楚的地方. EPC和單個核細胞在發(fā)育上有何關系？如何確定EPC在循環(huán)中的量及其富集、分離方法?EPC在體外不同細胞因子調(diào)控下具有可塑性的誘導分化機制如何？如何近一步明確EPC的增殖潛能，并尋求最佳擴增體系以提供足量的有活力的細胞源，以便更好地應用？這些都是值得研究的問題. 我們研究了人外周血單個核細胞分化為EPC并應用于缺血性疾病治療的可行性. 在

16、我們的培養(yǎng)體系中, 人外周血單個核細胞貼壁呈梭形生長，并表達EPC特異性抗原標志，數(shù)量也明顯擴增. 這說明人外周血單個核細胞在體外一定條件下可以分化為EPC，且較成熟內(nèi)皮細胞有明顯的增殖優(yōu)勢. 雙色熒光標記證實通過局部多點注射的方法，EPC可以整合到了缺血后肢的新生血管內(nèi),這種整合促進了缺血部位血管重建過程,表現(xiàn)為毛細血管密度較對照組高,并且治療組的缺血肢體大多得以挽救,而對照組則以后肢壞死或脫落為主. 我們采用人外周血單個核細胞，而沒有采用單純的CD133或者CD34陽性細胞來進行EPC的誘導和培養(yǎng)，是考慮到細胞的誘導、分化是一個復雜的過程，是多種細胞間相互調(diào)控作用的結果，細胞太單一反而不利

17、于細胞的分化；在培養(yǎng)過程中棄去培養(yǎng)48 h內(nèi)的貼壁細胞，可以避免外周血中成熟內(nèi)皮細胞等對實驗的干擾. 我們采用目前大家比較公認的EPC表面標記來對培養(yǎng)的細胞進行鑒定，保證了細胞的性質(zhì)和純度. M199對照組有2條后肢未出現(xiàn)明顯壞死，3條后肢趾端壞死，考慮與M199培養(yǎng)液中的VEGF和bFGF的促進血管新生有關.【參考文獻】1Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesisJ. Science, 1997,275(5302):9

18、64-967.2楊晨,張志華,盧士紅,等. 臍血內(nèi)皮祖細胞移植改善肢體缺血的研究J. 中華醫(yī)學雜志,2003,83（16）:1437-1441.3Xu QB.Endothelial progenitor cells in angiogenesisJ. Shengli Xuebao, 2005,57(1):1-6.4Khakoo AY, Finkel T. Endothelial progenitor cellsJ. Annu Rev Med, 2005,56:79-101.5Asahara T, Masuda H, Takahashi T,et al.Bone marrow origin of

19、 endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularizationJ. Circ Res, 1999,85（3）:221-228.6Khan SS, Solomon MA, McCoy JP Jr.Detection of circulating endothelial cells and endothelial progenitor cells by flow cytometryJ.Cytometry B Clin Cytom, 2005,64(1):1-8.7