農桿菌感受態(tài)制備

1、版本一 1.1農桿菌感受態(tài)細胞的制備 1.1.1. 取-70保存的EHA105于含50g/ml鏈霉素平板劃線，28培養(yǎng)。 1.1.2. 挑取單菌落接種于5ml YM液體培養(yǎng)基中，220rpm 28振蕩培養(yǎng)12-16 hr。 1.1.3. 取2ml菌液轉接于100ml YM液體培養(yǎng)基中，28220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5。 1.1.4. 轉入無菌離心管，5000rpm離心5min,去上清液。 1.1.5. 加入10ml預冷的0.1M的CaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置20min。45000rpm離心5min，去上清。

2、60;1.1.6. 加入4ml預冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，輕輕懸浮。 1.1.7. 農桿菌懸浮液分裝于無菌Eppendorf管中，每管200l凍存于-70。 1.2. 雙元載體轉化農桿菌EHA105 取1g左右的質粒DNA加入到200ml EHA105感受態(tài)細胞中，混勻后，冰浴30min，-70放置10min 。再在37水浴5min或42水浴1min，接著冰浴2min，加入800mlYM液體培養(yǎng)基28，175rpm搖培3hr后涂在含50g/ml Kanamycin的YM平板上。28培養(yǎng)到形成單菌落。其中 YM 可以用LB 代替 ，第一次的 CaC

3、l2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。版本二 普通農桿菌感受態(tài)制備與轉化： 1. 挑單菌落于2ml YEP培養(yǎng)基（含Rif20mg/ml）中28過夜活化。 2. 取2ml過夜菌液接種于50ml YEP培養(yǎng)基中28生長至OD600約等于0.5左右（4hr）。 3. 5k rpm離心5分鐘。 4. 在10ml 0.15M NaCl中懸浮細胞。 5. 5 krpm離心5分鐘，懸浮細胞于20ml冰預冷的CaCl2。 如不是馬上使用，可以將之按200ul分裝儲存于-80待用

4、。 6. 加1ug DNA于200ul感受態(tài)細胞中，冰上放置30分鐘。 7. 液氮中冷凍1分鐘。 8. 37水浴溶化細胞。 9. 加1ml YEP培養(yǎng)基，28搖床培養(yǎng)2-4hr（低速）。 10. 離心1分鐘，懸浮細胞在100ul YEP培養(yǎng)基中。 11. 涂板，28培養(yǎng)2-3天。 版本三 農桿菌感受態(tài)細胞的制備 1.挑取少許農桿菌LBA4404，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基 (含50mg/L STR)中，28、200r/mim培養(yǎng)過夜。 2.取2ml培養(yǎng)物于LB液體培養(yǎng)基 (含50mg/L ST

5、R) 中繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD800 為0.5左右。 3.將培養(yǎng)物置冰浴中30min，4、5000r/min、離心5min，棄去上清液。 4.用10ml冷的0.1mol/L NaCl懸浮菌液。 5.4、5000r/min，離心5min，棄去上清液。 6.用1ml冷的CaCl2 (20mmol/L)懸浮，分裝成50l管，液氮中冷凍后至-80保存。 農桿菌感受態(tài)細胞的制備： 1.試劑配制：solution1 ： Rbcl 1.21g 100mM MgCl2.4H2O 1.02g 50mM K-Acetate 0.29g 3

6、0mM CaCl2.2H2O 0.15g 10mM Glycerol 15% 15ml，定容至100ml。 pH=5.8，121度，高壓滅菌30min。 solution2： Rbcl 0.12g 10mM K-Acetate 0.1g 10mM CaCl2.2H2O 1.1g 75mM Glycerol 15% 15ml，定容至100ml。 pH=5.8，121度，高壓滅菌30min。 2.農桿菌感受態(tài)細胞的培養(yǎng)： 15-20ml無抗生素的LB培養(yǎng)基，用牙簽挑取農桿菌放入小三角瓶中，28度12

7、0轉震蕩培養(yǎng)過夜。（注意牙簽和小三角瓶均需滅菌） 3.制備感受態(tài)農桿菌：把已培養(yǎng)過夜的小三角瓶中的農桿菌分裝到1.5ml小離心管中，室溫下，4，000g，離心10min。棄去上清，每管加0.5ml solution1，用手指彈管底部，以使菌體懸浮。冰上放置15mim-2h。4度，4，000g， 離心10min。取出后放在冰上，棄去上清，每管加0.5ml solution2，用手指彈管底部，以使菌體懸浮，冰上放置15mim。分裝 感受態(tài)農桿菌 ，每管可分裝3-4管。用液氮速凍后至-80冰箱中保存。版本四 1) 從新鮮YEP（5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，10

8、g/L酵母浸出物，10g/L瓊脂，50mg/L利福平，pH7.0）平板上挑取農桿菌 LBA4404的單菌落，接種于5ml液體YEP培養(yǎng)基（含50mg/L利福平）中，28 200r/min振搖培養(yǎng)過夜。 2) 取1ml菌液接種于50ml液體YEP培養(yǎng)基（含50mg/L利福平）中擴大培養(yǎng)，28 200r/min振搖培養(yǎng)至OD600為0.5。 3) 冰浴30min，4 5000r/min離心收集菌體，重懸浮于10ml 0.15mol/L NaCl溶液中。 4) 再次4 5000r/min離心收集菌體，重懸浮于1ml 20mmol/LCaCl2溶液中，按200&m

9、icro;l/管分裝。制備好的感受態(tài)細胞若不立即使用，液氮速凍1min后，放于-70冰箱保存，半年內使用。版本五 YEB培養(yǎng)基（用于農桿菌培養(yǎng)及感受態(tài)制備） 蛋白凍（peptone） 5g/L 蔗糖（sucrose） 5g/L 牛肉膏（Beef extract） 1g/L 酵母提取物（Yeast extract） 5g/L 硫酸鎂（MgSO47H2O） 0.5g/L 固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂粉，Ph7.2 高壓滅菌。 農桿菌電擊感受態(tài)制備 方法一 1、 挑取單菌落于YEB振蕩過夜28培養(yǎng)。

10、60;2、 以1:200接種于400500mlYEB培養(yǎng)基中（2000ml三角瓶中），搖菌至0.81.0，冰浴10min。 3、 2000g， 4離心10mi后棄上清，用預冷的10甘油重懸沉淀。 4、 3000g，4離心10min棄上清，用回流甘油重懸沉淀后集中在一管中。 5、 3000g，4離心10min棄上清，用回流甘油重懸沉淀。 6、 50l分裝一管，70保存。 方法二 1、 O/N culture in 10ml of YEB/Rif 100+Str 100 at 28; 2、 1:100 dilutiongrow

11、till OD600=0.50.8,on ice 30 min; 3、 Pellet at 6000rpm for 20min in precooled centrifuge, then resuspend with 1 Vol of precooled H2O; 4、 Pellet at 6000rpm for 20min, then resuspend with 0.5 Vol of precooled H2O; 5、 Pellet at 6000rpm for 20min, then resuspend with 1/50 Vol of precooled 10% glycerol; 6、 Pellet at 6000rpm for 20min, then resuspend with 1/500 Vol of precooled 10% glycerol; 7、 Aliquot 80l. 農桿菌化學感受態(tài)制備 1、 挑取單菌落于YEB振蕩過夜28培養(yǎng)；