口腔鱗狀細(xì)胞癌近紅外拉曼光譜特征及其診斷價值研究

1、口腔鱗狀細(xì)胞癌近紅外拉曼光譜特征及其診斷價值研究    作者：李一1,文志寧2,李龍江1,3,李夢龍2作者單位：1.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實驗室，四川大學(xué)，四川 成都 610041;2.四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院 分析化學(xué)教研室，四川 成都 610064;3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 頭頸腫瘤外科，四川 成都                      &

2、#160;                                 【摘要】目的探索近紅外拉曼光譜技術(shù)及化學(xué)計量法在口腔鱗狀細(xì)胞癌診斷中的應(yīng)用價值。方法收集正?？谇火つそM織10例、鱗狀細(xì)胞癌組織20例、白斑30例進(jìn)行近紅外拉曼光譜掃描，分析不同病變類型的特征性光譜，通過化學(xué)計量法進(jìn)

3、行分析建模，并評價其分類診斷效力。結(jié)果 相對于正常組織，鱗狀細(xì)胞癌及白斑中DNA、蛋白及脂類合成增強(qiáng)，表現(xiàn)出較明顯的增殖活性。在對鱗狀細(xì)胞癌和正常組織的建模比較中，診斷準(zhǔn)確度98.81%;在鱗狀細(xì)胞癌與白斑建模診斷中，診斷準(zhǔn)確度96.30%。結(jié)論 近紅外拉曼光譜檢測結(jié)合支持向量機(jī)分類建模技術(shù)，可以檢測到口腔正常黏膜、白斑及鱗狀細(xì)胞癌樣本中的生化物質(zhì)變化，并進(jìn)行準(zhǔn)確分類建模診斷。     【關(guān)鍵詞】  口腔鱗狀細(xì)胞癌; 白斑; 近紅外拉曼光譜; 支持向量機(jī); 診斷     口腔癌的發(fā)病率位居全身惡性腫瘤發(fā)病率的前10位，是威脅

4、人類健康的主要疾病之一1。目前雖然出現(xiàn)了多種全新治療方法，使患者治療后的生存質(zhì)量明顯提高，但生存率卻無明顯改善2，術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是患者死亡的主要原因。究其死亡根本原因在于早期診斷方法匱乏，錯失了治療的最佳時機(jī)。研究3表明，拉曼光譜技術(shù)對構(gòu)成人體的基本生化物質(zhì)非常靈敏，通過光譜分析可以獲得大量有關(guān)生化成分含量、構(gòu)型構(gòu)象、組成及構(gòu)成比的信息。拉曼光譜技術(shù)在惡性腫瘤的診斷和治療等方面已得到跨越式發(fā)展。應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)檢測消化系統(tǒng)、乳腺、女性生殖系統(tǒng)等癌變細(xì)胞內(nèi)生化物質(zhì)的變化發(fā)現(xiàn)，通過組織細(xì)胞光譜特征的檢測可有效地在微觀水平反映組織形態(tài)學(xué)的細(xì)微變化，為癌癥的早期診斷提供強(qiáng)大的理論依據(jù)4-7。本研究采用

5、近紅外拉曼光譜技術(shù)及化學(xué)計量法，對口腔正常黏膜、白斑(oral leukoplakia，OLK)及口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)組織標(biāo)本內(nèi)組織及細(xì)胞生化物質(zhì)的變化進(jìn)行檢測，應(yīng)用徑向基核函數(shù)支持向量機(jī)對不同病變進(jìn)行分類建模，并驗證其分類準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，以了解口腔黏膜細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的光譜學(xué)變化規(guī)律，為應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)早期診斷口腔黏膜惡性病變奠定理論基礎(chǔ)。     1 材料和方法     1.1 臨床資料     收集2006年1月2007年12月在四川

6、大學(xué)華西口腔醫(yī)院頜面外科進(jìn)行治療的30例口腔黏膜白斑患者和20例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的病理切片，所有病理切片均根據(jù)世界衛(wèi)生組織腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)(2005年版)8診斷。同時收集10例人群的口腔正常黏膜組織，常規(guī)固定，石蠟包埋。對每一標(biāo)本連續(xù)切片，厚度為5 m，隨機(jī)選取相鄰2張并貼片。其中1張切片以蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，邀請四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院經(jīng)驗豐富的2位病理學(xué)家及1位頭頸腫瘤外科醫(yī)生，將HE切片置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行會診，精確定位黏膜白斑及鱗狀細(xì)胞癌所在區(qū)域，并在切片上標(biāo)示;另1張切片于定制的CaF2晶片上貼片，常溫下風(fēng)干后，以純二甲苯脫蠟30 min，浸

7、入95%乙醇內(nèi)洗滌30 min，風(fēng)干，對照HE切片，確定此切片的組織病理類型及相應(yīng)病損區(qū)域。     1.2 傅立葉轉(zhuǎn)換近紅外拉曼光譜檢測     采用Nicolet Nexus670型紅外顯微拉曼光譜儀(Nicolet公司，美國)對病損區(qū)域進(jìn)行掃描，獲得其特征性拉曼光譜。掃描的具體參數(shù)為：激光功率1 W，波長1 064 nm，波數(shù)范圍1003 800 cm-1。應(yīng)用光譜處理軟件OMNIC for Raman 6.0對獲取的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正，獲得不同分類組織的平均光譜，通過分類平均光譜相減獲得正常組織、白斑、鱗狀細(xì)胞癌光譜間的差異

8、光譜，結(jié)合以往拉曼光譜研究中所獲得峰位置歸屬指認(rèn)差異光譜中特征峰所代表的化學(xué)物質(zhì)變化信息。     1.3 化學(xué)計量法分析     對基線校正的譜圖采用Matlab軟件的小波函數(shù)bior4.4進(jìn)行平滑處理，采用四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院分析化學(xué)教研室編寫的Matlab支持向量機(jī)程序建立不同疾病的拉曼光譜數(shù)據(jù)診斷模型，采用“留一法”校驗診斷模型的準(zhǔn)確度，計算其特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度、Matthew相關(guān)系數(shù)9和預(yù)測穩(wěn)定性10。相關(guān)公式如下：特異性Sp=;靈敏度Se=;準(zhǔn)確度Acc=;Matthew相關(guān)系數(shù)MCC=;預(yù)測穩(wěn)定性error=;R=。其中

9、，TP為正樣本預(yù)測正確數(shù)，F(xiàn)P為正樣本預(yù)測錯誤數(shù)，TN為負(fù)樣本預(yù)測正確數(shù)，F(xiàn)N為負(fù)樣本預(yù)測錯誤數(shù)。     2 結(jié)果     本研究共獲得正常、白斑及鱗狀細(xì)胞癌病變區(qū)域的特征性拉曼光譜154張，其中正常組織46張，輕度異常增生40張，中度異常增生16張，重度異常增生32張，鱗狀細(xì)胞癌20張。正常組織、白斑及鱗狀細(xì)胞癌的平均光譜見圖1。從圖1可見，不同病變類別的光譜在6001 800 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)存在一定的差異。從上到下依次為鱗狀細(xì)胞癌、白斑及正常組織的平均光譜。圖 1 正常組織、白斑及鱗狀細(xì)胞癌的平均光譜   

10、;  2.1 平均差異光譜分析     鱗狀細(xì)胞癌與正常組織、白斑與正常組織、鱗狀細(xì)胞癌與白斑間的差異光譜見圖24。從圖2可見，口腔正常黏膜與鱗狀細(xì)胞癌的平均光譜差異明顯，主要在5002 200 cm-1范圍內(nèi)，其中747、897、930、1 060、1 092、1 125、1 610及1 666 cm-1峰位的增強(qiáng)提示在鱗狀細(xì)胞癌中DNA、蛋白及脂類合成增強(qiáng)，表現(xiàn)出較明顯的增殖活性，而在3 250 cm-1峰位的減弱提示其蛋白質(zhì)N-H伸縮震動降低，也可作為診斷的標(biāo)準(zhǔn)。白斑與正常組織相比其差異沒有鱗狀細(xì)胞癌與正常組織明顯，具有意義的是，751、780和1

11、 071 cm-1峰位的增強(qiáng)提示其色氨酸、DNA及脂質(zhì)含量升高，顯示較強(qiáng)的增殖活性，而白斑在3 250 cm-1峰位的降低也可作為診斷依據(jù)(圖3)。鱗狀細(xì)胞癌相對于白斑，其差異主要在5002 200 cm-1范圍內(nèi)，其中747、897、1 060、1 092、1 125、1 344及1 610 cm-1峰位的增強(qiáng)，提示在鱗狀細(xì)胞癌中DNA、蛋白及脂類合成較白斑增強(qiáng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖活性，但此差別較鱗癌與正常組織差別明顯減弱(圖4)。圖 2 鱗狀細(xì)胞癌與正常組織間的差異光譜Fig 2 Subtracted mean spectrum of normal tissue and OSCC圖 3 白斑

12、與正常組織間的差異光譜     2.2 化學(xué)計量法診斷分類     在經(jīng)過小波變換后，對不同分類組織的拉曼光譜信息通過支持向量機(jī)進(jìn)行分析。選擇正則化參數(shù)C=3，核函數(shù)寬度=2，在46個正常組織的拉曼光譜中，45個樣本被歸于正常組，正確率97.83%;在20個鱗狀細(xì)胞癌的拉曼光譜中，全部光譜都被劃分于鱗狀細(xì)胞癌組，正確率100%。圖 4 鱗狀細(xì)胞癌與白斑間的差異光譜Fig 4 Subtracted mean spectrum of OLK and OSCC選擇正則化參數(shù)C=3，核函數(shù)寬度=2，在46個正常組織的拉曼光譜中，27個樣本被歸

13、于正常組，正確率58.70%;在88個白斑的拉曼光譜中，74個樣本歸于白斑組，正確率84.09%。去除輕度異常增生的拉曼光譜后，選擇正則化參數(shù)C=3，核函數(shù)寬度=4，在46個正常組織的拉曼光譜中，有38個樣本被歸于正常組，正確率82.61%;在48個白斑的拉曼光譜中，39個樣本被歸于白斑組，正確率81.25%。選擇正則化參數(shù)C=3，核函數(shù)寬度=1，在20個鱗狀細(xì)胞癌的拉曼光譜中，19個樣本被歸于鱗狀細(xì)胞癌組，正確率95.00%;在88個白斑的拉曼光譜中，85個樣本被歸于白斑組，正確率96.59%。去除重度異常增生的拉曼光譜后，選擇正則化參數(shù)C=3，核函數(shù)寬度=1，結(jié)果在38個鱗狀細(xì)胞癌拉曼光譜

14、中，所有樣本都被歸于鱗狀細(xì)胞癌組，正確率100%;在56個白斑的拉曼光譜中，53個樣本歸于白斑組，正確率94.64%。根據(jù)以上結(jié)果，計算所得診斷模型分類的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度、Matthew相關(guān)系數(shù)和預(yù)測穩(wěn)定性見表1。     3 討論     近紅外拉曼光譜具有以下特點(diǎn)而適合于人體組織檢測3：1)人體組織對近紅外波長激發(fā)光的消光系數(shù)較小，光束能夠更深地進(jìn)入組織，為較大組織塊和表面下層組織的研究提供機(jī)會;2)更小的光吸收可降低樣品的光分解作用，從而可應(yīng)用更高的激光能量激發(fā)試樣，獲得更強(qiáng)烈的拉曼散射效應(yīng);3)近紅外波長的激發(fā)光能輕易通

15、過光導(dǎo)纖維傳遞，為近距離獲得組織樣本的診斷性拉曼光譜提供可能;4)水份對近紅外激光的吸收作用很弱，從而在近紅外拉曼光譜檢測中消除了水份干擾，在水份構(gòu)成70%95%細(xì)胞組分的情況下，這一特點(diǎn)尤為重要。Krishna等4應(yīng)用顯微拉曼光譜儀結(jié)合近紅外拉曼光譜儀分析，發(fā)現(xiàn)正常組織、良性腫瘤及惡性腫瘤的平均光譜存在明顯差異;惡性腫瘤的平均光譜與正常組織差別較大，最明顯的表現(xiàn)為酰胺帶強(qiáng)度下降、CH2帶輕微位移、8001 200 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)多個譜帶及酰胺帶強(qiáng)度相對改變，這可以作為區(qū)分不同病變的標(biāo)準(zhǔn)。Kumar等5對正常和惡變的新鮮胃黏膜進(jìn)行近紅外拉曼光譜掃描發(fā)現(xiàn)，在酰胺、帶和CH2相應(yīng)波數(shù)范圍內(nèi)，正

16、常胃黏膜中含有更高的脂質(zhì)成分，而惡變黏膜中蛋白質(zhì)成分更加豐富。本研究通過不同組織分類的平均差異光譜發(fā)現(xiàn)，相對于正?？谇火つ?，白斑和鱗狀細(xì)胞癌在活躍增殖過程中，由于其分裂、生長加速而伴有明顯的遺傳物質(zhì)含量升高、細(xì)胞合成功能增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)RNA、DNA及相應(yīng)核苷酸、蛋白質(zhì)及脂類含量升高，在其拉曼光譜上以特征峰或相應(yīng)峰值升高表現(xiàn)出來，可以用作鑒別診斷。拉曼光譜數(shù)據(jù)中包含大量無關(guān)緊要的信息，在保證拉曼光譜基本特征不變的前提下，需要結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法提取其中有意義的內(nèi)容，并去除偽峰干擾以建立判別模型，為惡性腫瘤診斷和治療提供客觀依據(jù)。本研究采用支持向量機(jī)進(jìn)行分析，它是一種具有學(xué)習(xí)功能的計算分析方法

17、，其最大的特點(diǎn)在于其所需的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集較小，結(jié)果比較穩(wěn)定，鑒于研究中樣本數(shù)量限制及診斷準(zhǔn)確性的要求，這一點(diǎn)在醫(yī)學(xué)研究中尤為重要。在對鱗狀細(xì)胞癌和正常組織的建模比較中，診斷模型的分類功能較強(qiáng)大，其對于鱗癌和正常組織的分類結(jié)果較準(zhǔn)確，并且診斷模型預(yù)測穩(wěn)定性較高。白斑與正常組織的分類比較結(jié)果并不十分理想。在去除訓(xùn)練集中輕度異常增生的數(shù)據(jù)后，其分類效果有所提高，由此可知白斑與正常組織的拉曼光譜存在客觀差別，但鱗癌和正常組織的差別明顯減小，這說明白斑在正常組織和鱗癌間處于過渡狀態(tài);在去除輕度異常增生的訓(xùn)練數(shù)據(jù)后，兩者間的分類效力提高，其原因可能在于輕度異常增生與正常組織差別較小，從而在所有白斑樣本和正常組

18、織的對比中削弱了中、重度異常增生的光譜特異性，導(dǎo)致白斑總體與正常組織的分類效力降低。鱗狀細(xì)胞癌與白斑的分類比較結(jié)果較為理想。在去除訓(xùn)練集中重度異常增生的數(shù)據(jù)，其分類效果有所提高，尤其是分類準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性提高明顯。由此可以推論鱗狀細(xì)胞癌與白斑存在較明顯的差異，其差異程度較白斑和正常組織更大，說明白斑在組織分化上更靠近正常組織;在去除重度黏膜異常增生的訓(xùn)練數(shù)據(jù)后，模型分類效果有所提高，這一結(jié)果與病理分類相互印證，即在病理分類中，重度黏膜異常增生已表現(xiàn)明顯的惡性傾向，發(fā)生惡變的關(guān)鍵性突變機(jī)會較輕、中度異常增生更大;此外，在病理分類中的誤判也可能造成以上分類結(jié)果的改變，即將鱗狀細(xì)胞癌誤分于重度黏膜異常

19、增生組，從而導(dǎo)致差異減小，影響分類效力。     【參考文獻(xiàn)】     1 Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Estimating the world cancerburden： Globocan 2000J. Int J Cancer, 2001, 94(2)：     2 Brown AE, Langdon JD. Management of oral cancerJ. Ann RColl Surg Engl, 1995, 77(6)：   &

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