環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究--學(xué)位論文

1、環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究-學(xué)位論文 暨南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 摘要米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi Hansen)是中國沿海常見的赤潮原因種之一,能夠產(chǎn)生溶血性毒素和魚毒素,對沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成巨大威脅。氮磷生理生態(tài)學(xué)研究表明環(huán)境中硝酸鹽與磷酸鹽濃度的升高對于米氏凱倫藻的增殖具有顯著的促進(jìn)作用。但是,關(guān)于硝酸鹽與磷酸鹽如何影響米氏凱倫藻的光合作用、核酸合成以及蛋白表達(dá)并進(jìn)而影響藻細(xì)胞增殖與赤潮形成的深層機(jī)制仍有待研究。 本實驗以 f/2 培養(yǎng)基(Guillard,1975)為基礎(chǔ),配制氮脅迫、磷脅迫以及含

2、氮磷對照培養(yǎng)基培養(yǎng)米氏凱倫藻。隔天計數(shù)藻細(xì)胞密度并同時測量培養(yǎng)基中的硝酸鹽與磷酸鹽濃度值,得到不同培養(yǎng)條件下米氏凱倫藻種群增殖曲線與營養(yǎng)鹽濃度變化曲線,對數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量并進(jìn)行多重性分析與相關(guān)性分析。用流式細(xì)胞儀測定氮脅迫、磷脅迫與對照組米氏凱倫藻細(xì)胞周期發(fā)展與葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度變化,得到不同培養(yǎng)條件下米氏凱倫藻種群細(xì)胞周期發(fā)展情況與葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度變化情況直方圖。對于不同培養(yǎng)條件下提取的藻細(xì)胞蛋白樣品采用 SDS-PAGE偶聯(lián) MALD TOF/TOF或 LTQ Orbitrap XL二級質(zhì)譜鑒定對應(yīng)的蛋白種類表達(dá)情況,得到不同培養(yǎng)條件下米氏凱倫藻差異蛋白表達(dá)情況,根據(jù)差異蛋白功能闡釋分析米氏凱倫

3、藻在蛋白層面對環(huán)境氮磷脅迫影響的響應(yīng)機(jī)制。 對氮脅迫、磷脅迫以及氮磷對照培養(yǎng)條件下米氏凱倫藻細(xì)胞密度變化數(shù)據(jù)、硝酸鹽與磷酸鹽濃度變化數(shù)據(jù)、葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度數(shù)據(jù)、細(xì)胞周期數(shù)據(jù)以及蛋白表達(dá)差異的分析表明: (1)環(huán)境中硝酸鹽與磷酸鹽對/增殖的 spearman 相關(guān)系數(shù) 0.968,高濃度磷酸鹽(19?mol/L)的變化與米氏凱倫藻種群增殖的 spearman 相關(guān)系數(shù) 0.991。 (2)環(huán)境中硝酸鹽的缺乏(3.7?mol/L)對于米氏凱倫藻單位細(xì)胞葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度影響不顯著(p>0.05);環(huán)境中磷酸鹽的缺失(0.77?mol/L)會使米氏凱倫藻單位細(xì)胞葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度顯著下降(p<0.

4、05),小粒徑米氏凱倫藻亞族群形成,細(xì)胞光合效率下降。 (3)環(huán)境中硝酸鹽的缺乏(3.7?mol/L)對于米氏凱倫藻細(xì)胞 dsDNA 合成以及細(xì)胞周期的發(fā)展具有顯著抑制作用(p<0.05);環(huán)境中磷酸鹽的缺乏(0.77?mol/L)對于米氏凱倫藻細(xì)胞 dsDNA合成以及細(xì)胞周期的發(fā)展具有非常顯著的抑制作用(p<0.01) 。 (4)環(huán)境中硝酸鹽的缺乏(3.7?mol/L)致使米氏凱倫藻細(xì)胞 16 種蛋白表達(dá)上調(diào)被MALDI TOF/TOF 與 LTQ Orbitrap XL檢出,分析差異蛋白功能認(rèn)為米氏凱倫藻在硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)、氮缺失信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸代謝、遺傳信息保護(hù)以及溶血素毒素產(chǎn)生等

5、方面對硝酸鹽缺乏產(chǎn)生了一系列的響應(yīng)。與硝酸鹽缺乏培養(yǎng)相比,含氮對照培養(yǎng)的米氏凱倫藻細(xì)胞中 11I 暨南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 蛋白表達(dá)上調(diào)被 MALDI TOF/TOF與 LTQ Orbitrap XL檢出,分析差異蛋白功能發(fā)現(xiàn)在硝酸鹽充足情況下,米氏凱倫藻參與光呼吸、增殖,蛋白質(zhì)修飾成熟,基因組與細(xì)胞骨架穩(wěn)定性以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)上調(diào)。 (5)環(huán)境中磷酸鹽的缺乏(0.77?mol/L)致使米氏凱倫藻細(xì)胞 11 種蛋白表達(dá)上調(diào)被 LTQ Orbitrap XL檢出,分析差異蛋白功能認(rèn)為米氏凱倫藻通過相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、液泡磷釋放、自身磷脂降解、有

6、機(jī)酸合成以及吞噬營養(yǎng)等方面對磷酸鹽缺乏產(chǎn)生了一系列的響應(yīng)。與磷酸鹽缺乏培養(yǎng)相比,含磷對照的米氏凱倫藻細(xì)胞中 4 種蛋白表達(dá)上調(diào)被 LTQ Orbitrap XL 檢出,分析差異蛋白功能發(fā)現(xiàn)在磷酸鹽充足情況下,米氏凱倫藻參與細(xì)胞增殖、正常糖酵解、SAM 循環(huán)及多胺合成蛋白表達(dá)上調(diào)。 (6)在硝酸鹽缺乏培養(yǎng)下的藻細(xì)胞蛋白中鑒定到溶血素蛋白 calcium binding hemolysin protein(gi|254513175) ,在米氏凱倫藻赤潮溶血性毒理效應(yīng)中起重要作用。 (7)在兩組對照實驗蛋白樣品中都檢出了細(xì)胞分裂周期蛋白 cell division cycle protein 48

7、Thalassiosira pseudonana CCMP1335(gi|224001990) ,在米氏凱倫藻種群增殖與赤潮形成過程中起重要作用。關(guān)鍵詞: 米氏凱倫藻;細(xì)胞密度;葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度;細(xì)胞周期;差異蛋白組;響應(yīng)機(jī)制II 暨南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 Abstract刪除的內(nèi)容: bloom Karenia mikimotoi Hansen is one of the most important harmful algal species in the Chinese 刪除的內(nèi)容: alongcoasts, which could pr

8、oduce hemolytic toxins and ichthyotoxins, resulting devastating economic 刪除的內(nèi)容: a刪除的內(nèi)容: and causeloss. Previous studies demonstrated that the increase of environmental nitrate and phosphate concentrations could promote the growth and reproduction of K. mikimotoi. Researches on intrinsic mechanisms r

9、egarding the effects of nitrate and phosphate on the K. mikimotoi photosynthesis, nuclear acids replications and differential proteins expressions remain to be carried out刪除的內(nèi)容: M Culture medium, made up by synthetic water including N-limited, P-limited and f/2 were 刪除的內(nèi)容: , applied to culture K. mi

10、kimotoi. Cell counts and nitrate or phosphate concentration assay were 刪除的內(nèi)容: used刪除的內(nèi)容: sperformed every other day. The data were analyzed by multi-comparison and corralation 刪除的內(nèi)容: availablemethods. Flowcytometry was applied to measure the population cell cycle evolution and chlorophyll fluorescen

11、ce intensity of this species. The data were executed one-way ANOVA analysis. SDS-PAGE tandem MALDI TOF/TOF or LTQ Orbitrap MS/MS spectrometry was employed to identify differential proteomics expression. Accoding to illustrated functions of differential proteins, proteomics mechanisms response to nit

12、rate or phosphate stress were estimatedExperimental data analysis elucidated conclusions were as follows: The elevation in environmental nitrate or phosphate concentrations imposed significant promotion on the growth of K. mikimotoi. High concentration 32?mol/L variations of nitrates spearman correl

13、ation coefficient with growth of Karenia mikimotoi was 0.968, while high concentration 19?mol/L variations of phophates spearman correlation coefficient with growth of Karenia mikimotoi was 0.991Chlorophyll fluorescence intensity of K. mikimotoi didnt decrease significantly p>0.05. in the nitrate

14、 stress condition3.7?mol/L. Environmental phosphate stress 0.77?mol/L imposed significant drop on its chlorophyll fluorescence intensity p<0.05. The environmental phosphate stress rendered the emergence of reduced apical axis length subpopulation and low efficiency of photosynthesisEnvironmental

15、nitrate stress 3.7?mol/L inhibited the replication of dsDNA significantly p<0.05, while environmental phosphate stress 0.77?mol/L prevented the replication of dsDNA remarkably p<0.01Environmental nitrate stress 3.7?mol/L brought about expression rise of 16 species of III 暨南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米

16、氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 proteins which were identified by MALDI TOF/TOF and LTQ Orbitrap XL spectrometryInvestigations of differential proteins functions demonstrated the proteomic mechanism of Kmikimotoi response to nitrate stress, which was composed of nitrate transportation, nitrate stress signal transd

17、uction, amino acid metabolism,nuclear acids protection and the production of hemolysin protein. In contrast to nitrate stress culture, 11 species of proteins were expressed greatly in nitrate sufficient culture. Analysis of differential proteins functions demonatrated the proteomic mechanism of K. m

18、ikimotoi response to nitrate sufficiency which included photorespiration, reproduction, protein accelerating maturity, genome and cytoskeleton stability and nitrate sufficiency signal transductionEnvironmental phosphate stress 0.77?mol/L brought about expression rise of 11 species of proteins which

19、were identified by LTQ Orbitrap XL spectrometry. Investigations of differential proteins functions demonstrated the proteomic mechanism of K. mikimotoi response to phosphate stress, which was composed of phosphate stress signal transduction, vacuolar phosphate release, phospholipid degradation, orga

20、nic acid composition and phagotrophyContrary to phosphate stress condition, 4 species of differential proteins were identified. Analysis of these proteins functions demonstrated the proteomic mechanism of K. mikimotoi response to phosphate sufficiency which included cell reproduction, flourishing na

21、tural glycosis, SAM cycle or polyamine productionHemolytic calcium binding hemolysin protein gi|254513175 was indentified only in the nitrate absent condition, which exerted important influence on the hemolytic effect of Kmikimotoi algal bloomsCell division cycle protein 48 gi|224001990 was indentif

22、ied in both control experiments, which impacted the growth of K. mikimotoi fundamentallyKeywords: Karenia mikimotoi; cell density; chlorophyll fluorescence intensity; differential proteomics; response mechanismIV 暨南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 目錄 摘要.I AbstractIII 目錄V 第一章 緒論.1 1.1 米氏凱倫藻形態(tài)分類特征

23、.1 1.2 米氏凱倫藻赤潮的廣泛發(fā)生及毒素研究.1 1.3 米氏凱倫藻氮磷營養(yǎng)生理生態(tài)研究2 1.4 植物對環(huán)境氮磷的分子生物學(xué)響應(yīng)機(jī)制.3 1.4.1 植物 NO ?吸收與同化代謝途徑.4 31.4.2 植物 NO ?信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及氮脅迫響應(yīng)4 31.4.3 植物磷吸收代謝途徑.5 1.4.4 植物磷脅迫響應(yīng)機(jī)制.6 1.5 海洋藻類分子生物學(xué)研究進(jìn)展.7 第二章 材料與方法.9 2.1 實驗材料.9 2.1.1 實驗藻種9 2.1.2 主要設(shè)備儀器.9 2.1.3 主要試劑.10 2.1.4 主要試劑配制方法10 2.2 實驗方法 11 2.2.1 米氏凱倫藻氮、磷缺失培養(yǎng)實驗 11 2.2

24、.2 米氏凱倫藻細(xì)胞密度與營養(yǎng)鹽濃度測定12 2.2.3 米氏凱倫藻蛋白質(zhì)提取.12 2.2.4 蛋白質(zhì)濃度測定.12 2.2.5 蛋白樣品的 SDS-PAGE.13 2.2.6 凝膠蛋白的切取.13 2.2.7 蛋白質(zhì)酶解13 2.2.8 LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜分析14 2.2.9 MALDI TOF/TOF質(zhì)譜分析.14 2.2.10 流式細(xì)胞儀測定米氏凱倫藻細(xì)胞周期與葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度14 2.2.11 數(shù)據(jù)分析15 第三章 結(jié)果與分析16 3.1 硝酸鹽與磷酸鹽對米氏凱倫藻種群增殖的影響.16 3.2 硝酸鹽與磷酸鹽對米氏凱倫藻葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響.19 3.3 硝酸鹽與磷酸鹽

25、對米氏凱倫藻細(xì)胞周期的影響.21 3.4 硝酸鹽與磷酸鹽對米氏凱倫藻蛋白表達(dá)的影響.24 3.4.1 硝酸鹽對米氏凱倫藻蛋白表達(dá)的影響.24 3.4.2 磷酸鹽對米氏凱倫藻蛋白表達(dá)的影響.29 3.5 米氏凱倫藻赤潮溶血素蛋白分析32 3.6 米氏凱倫藻細(xì)胞分裂蛋白 TpCDC48 分析33 第四章 討論39 4.1 細(xì)菌的干擾和影響39 4.2 米氏凱倫藻生理生化需求對氮磷吸收策略的影響.40 V 暨南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 4.3 磷脅迫下米氏凱倫藻糖酵解機(jī)制探討40 4.4 米氏凱倫藻對硝酸鹽、磷酸鹽脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制探討.41 4.5

26、研究展望42 第五章 結(jié)論44 參考文獻(xiàn)46 附錄.51 在校期間發(fā)表論文及科研成果.110 致謝 111 VI 暨南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 第一章 緒論1.1 米氏凱倫藻形態(tài)分類特征 1935 年在日本京都 Gokasho 灣首次發(fā)現(xiàn)米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi Hasen) ,當(dāng)時定名為 Gymnodinium mikimotoi,中文譯名為米氏裸甲藻,之后該甲藻赤潮在世界各地的溫帶、亞熱帶及亞寒帶海區(qū)都曾出現(xiàn),屬于廣溫廣鹽赤潮藻,其曾用名包括 Gymnodinium nagasakiense、 Gyrodinium au

27、reolum和 Gymnodinium cf. nagasakiense等。 2000 年, Daugbjerg等根據(jù)裸甲藻的超微結(jié)構(gòu)以及部分 LSU rDNA測序信息將米氏凱倫藻從裸甲藻屬獨(dú)立出來1建立 Karenia 屬,相應(yīng)的 Gymnodinium mikimotoi 改名為 Karenia mikimotoi ,中文名譯為米氏凱倫藻。 米氏凱倫藻隸屬于甲藻門,裸甲藻目,凱倫藻屬。細(xì)胞綠褐色,圓形至橢圓形。背腹扁平,有時會形成細(xì)胞大小明顯不同的亞族群。上錐部半球形至寬圓錐形,在頂端處有一頂溝,自縱溝上端延伸至頂部并達(dá)背面。下錐部的底端有凹陷。橫溝位于中央或略前,左旋,縱溝從橫溝處開始到

28、底端。核橢圓形至豆形,位于細(xì)胞左側(cè)。10-20 個葉綠體散生于2細(xì)胞中,細(xì)胞長 18-37?m,寬 14-35?m 。Hansen 對其超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)它含有核室,具有核膜的特征,并且在鞭毛組織中有核纖維連接細(xì)胞核與縱向微管的根部,在縱向鞭毛中3含有層狀纖維,具有顯著的腹側(cè)突出和不透明物質(zhì) 。1.2 米氏凱倫藻赤潮的廣泛發(fā)生及毒素研究 我國有關(guān)于米氏凱倫藻的昀早記錄是 1986 年發(fā)生在廈門西港區(qū)的疑似米氏凱倫藻赤4潮 。由于近年來富營養(yǎng)化程度的加劇以及國際航運(yùn)的發(fā)展,我國沿海赤潮呈現(xiàn)出頻率高、時間長、范圍廣、危害大、新記錄和有毒種類增多的趨勢。其中米氏凱倫藻就是屬于我國危害較大的赤潮原因種。

29、1998 年 3-4 月,廣東珠江口及香港海域發(fā)生特大規(guī)模的米氏凱倫8藻赤潮,赤潮期間,赤潮生物密度達(dá) 0.63-7.60×10 個?升。此次赤潮給整個粵港地區(qū)海5水養(yǎng)殖業(yè)造成高達(dá) 3.5 億元的重大經(jīng)濟(jì)損失 。2005 年在我國渤海以及東海的長江口外海6域都曾發(fā)生大規(guī)模米氏凱倫藻赤潮,使當(dāng)?shù)氐木W(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類大量死亡 。從全球地理分布來看,米氏凱倫藻主要分布在大西洋東北部、歐洲沿岸和日本,此外,在美國東部沿海地區(qū)和加拿大的部分海域也有發(fā)現(xiàn)。1992 年,在美國東部沿海南大西洋有米氏凱倫藻赤潮發(fā)生。1993年,加拿大奎北克省沿岸和圣勞倫斯海灣米氏凱倫藻赤潮也首次出現(xiàn),當(dāng)時的水溫為 4-1

30、8,鹽度為 17-29。在歐洲,米氏凱倫藻赤潮出現(xiàn)在從挪威的 Senja島至西班牙的 Galician 的廣闊海域,但不包括像英吉利海峽和凱爾特海域這樣的混合水域。1995 年,1 暨南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 在法國的大西洋沿岸,米氏凱倫藻赤潮爆發(fā),導(dǎo)致 800-900 噸的翡翠貽貝(Mytilus edulis)死亡,另外還造成大量其他魚類的死亡。在歐洲海域米氏凱倫藻赤潮爆發(fā)的鹽度一般在730-36,或是 25(如在 Kattegat),有時甚至更低在 9左右 。 米氏凱倫藻赤潮危害魚類、無脊椎動物,引起養(yǎng)殖生物的大量死亡,主要是由于米氏凱藻

31、赤潮存在溶血性毒素和魚毒素,溶血性毒素和魚毒素作用的部位為鰓弓、鰓耙、鰓絲8及鰓小片,有溶解鰓組織細(xì)胞的作用 。對于毒素的分子結(jié)構(gòu)的分析,Satake 等從米氏凱倫藻中分離出兩種具有細(xì)胞毒性的多聚醚 Gymnocin-A 與 Gymnocin-B,采用核磁共振(NMR)和 CID MS/MS分析測定 Gymnocin-A結(jié)構(gòu)中含有 14 個相鄰的醚環(huán)和一個 2-甲基-2-丁烯側(cè)鏈,而 Gymnocin-B 的分子結(jié)構(gòu)中含有 15 個相鄰的醚環(huán)和一個 2-甲基-2-丁烯側(cè)9,10鏈 。Seki 等研究了米氏凱倫藻產(chǎn)生的裸甲藻素(Gymnodimine) ,它是一種五環(huán)衍生物,具有一個 C24 羧

32、酸和一個稠環(huán)丫嗪,分子式為 C H NO ,包含 5 個甲基,9個亞甲基,932 45 411個次甲基和 7 個季碳 。Parrish等分析了由米氏凱倫藻所產(chǎn)生的糖脂,其含有 17%的單半12乳糖二甘油酯和雙半乳糖二甘油酯,而這種糖脂被認(rèn)為可能是藻毒素的生物活性前體 。1.3 米氏凱倫藻氮磷營養(yǎng)生理生態(tài)研究 米氏凱倫藻赤潮的發(fā)生與海區(qū)的富營養(yǎng)化程度以及海水中磷酸鹽的含量有著很大的關(guān)系,對 2005 年發(fā)生在我國福建海域的米氏凱倫藻赤潮研究發(fā)現(xiàn):赤潮期間營養(yǎng)指數(shù) E長期維持在較高水平,E的峰值高達(dá) 140;當(dāng)磷酸鹽濃度為 15.5 mol/L,海區(qū)米氏凱倫藻10 cells/L,研究人員推測米氏

33、凱倫藻細(xì)胞密度與營養(yǎng)指數(shù)以及磷細(xì)胞密度達(dá)到峰值 1.98×10酸鹽濃度呈正相關(guān)性,在磷酸鹽充足的富營養(yǎng)化海域,米氏凱倫藻具有一定的競爭優(yōu)勢,13容易形成赤潮 。在實驗室培養(yǎng)條件下,黃凱旋研究環(huán)境氮對于米氏凱倫藻細(xì)胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)米氏凱倫藻能以氯化銨、硝酸鈉、亞硝酸鈉和尿素為氮源,而不能利用甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和 1,4-丁二胺鹽酸鹽。以外海天然海水為介質(zhì),在分別以氯化銨、硝酸鈉、14亞硝酸鈉和尿素為氮源時,米氏凱倫藻生長的昀適 N/P 比分別為 32、32、100 和 32 。李正峰研究米氏凱倫藻磷營養(yǎng)生理生態(tài)證實米氏凱倫藻可以吸收利用溶解態(tài)無機(jī)磷(DIP)?磷酸二氫鈉(NaH

34、PO )和有機(jī)磷(DOP)?三磷酸腺苷二鈉鹽(ATP)和甘油磷酸鈉2 4(G-P),且在高磷條件(低氮磷比)下比低磷條件(高氮磷比)生長的好。米氏凱倫藻對溶解態(tài)無機(jī)磷的吸收半飽和常數(shù) Ks 為 0.26 M,比絕大多數(shù)甲藻都要低;親和系數(shù) 為15417.6,比絕大多數(shù)甲藻都要高,所以米氏凱倫藻對介質(zhì)中 DIP 的競爭能力很強(qiáng) 。 國外學(xué)者研究環(huán)境因子對米氏凱倫藻生長的影響起步較早,Yamaguchi 等報道對于不2 暨南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 同的氮和磷的底物,米氏凱倫藻的 Ks 值小于其他甲藻,表明米氏凱倫藻僅需要很低濃度16的營養(yǎng)鹽來維持其

35、增殖,這使得它在自然環(huán)境下能比其競爭者更快的增殖 。Holligan 等發(fā)現(xiàn)米氏凱倫藻能在營養(yǎng)已耗盡的水域積累氮,使得細(xì)胞中的氮含量超過冬季硝酸鹽氮的17昀高濃度 。 Le Corre等測定了在米氏凱倫藻赤潮形成時的 Ushant鋒面的分層水域營養(yǎng)鹽-2 -1 -2 -1濃度,發(fā)現(xiàn)銨的吸收速率(3.75mmol?m ?h )遠(yuǎn)高于硝酸鹽氮的吸收速率(0.4mmol?m ?h ),-2 -1在 Ushant 鋒面的分層水域的銨的再生速率(3.4mmol?m ?h )也比整個海域的平均再生速-2 -1 18率(0.2mmol?m ?h )高 。在米氏凱倫藻赤潮形成初期,無機(jī)氮的量不可能是充足的,因

36、為之前的硅藻赤潮已經(jīng)將其耗盡,所以 Gentien 推測米氏凱倫藻增殖所需氮的 90%是以銨的形式被吸收,而這些銨幾乎全是由微型異養(yǎng)生物(d30?m)分解之前的硅藻殘體所提7供 。Videau 等報道硅藻赤潮藻體的分解與米氏凱倫藻赤潮的爆發(fā)之間通過腐胺的作用而發(fā)生聯(lián)系,腐胺是由鳥氨酸和精氨酸脫羧而合成,然后腐氨在多胺聚合酶的作用下進(jìn)一步19合成精氨與亞精氨,而精氨與亞精氨對于細(xì)胞的分裂增殖很重要 。Hirayama等報道當(dāng)培養(yǎng)基中的無機(jī)磷耗盡后米氏凱倫藻的堿性磷酸酶活性增強(qiáng),從而使其能利用一些有機(jī)磷20。 隨著人們對海區(qū)有機(jī)、顆粒形態(tài)營養(yǎng)鹽重要性及浮游植物生理活動多樣性認(rèn)識的加深,吞噬營養(yǎng)在海

37、洋浮游植物寡營養(yǎng)生存競爭以及海洋赤潮形成過程中的作用逐漸得到重21視 。吞噬營養(yǎng)(phagotrophy)發(fā)生的具體表現(xiàn)是細(xì)胞內(nèi)部食物泡或是外源性質(zhì)?；蚣?xì)胞22,23器等結(jié)構(gòu)的存在 。同屬裸甲藻目的一些甲藻種類如環(huán)溝藻(Gyrodinium galatheanum)、23,24紅色赤潮藻(Akashiwo sanguienum)等已被證實具有混合營養(yǎng)特征(mixotrophy) 。而米氏凱倫藻也被懷疑具有吞噬營養(yǎng)特征,但尚無實驗證實這一猜測。1.4 植物對環(huán)境氮磷的分子生物學(xué)響應(yīng)機(jī)制 甲藻細(xì)胞曾經(jīng)一度被看作是間核生物(mesokaryote),主要是由于其缺少組蛋白與核小體,其 DNA堿基 G

38、+C 含量高,且含有修飾性或稀有堿基,如 5-羥甲基尿嘧啶(HOMeU)6 6代替胸腺嘧啶(T) 、 N -甲基腺嘌呤(N -MeA)代替腺嘌呤(A)以及 5-甲基胞嘧啶(5-MeC)25代替胞嘧啶(C) ,此外其基因組存在非編碼重復(fù)性 DNA 序列等 ,于此,對于甲藻基因組的測序工作尚未完成,從而使得對于氮磷影響甲藻基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的研究較少進(jìn)行。關(guān)于甲藻硝酸鹽磷酸鹽吸收轉(zhuǎn)化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等分子生物學(xué)過程的研究很少,而對于高等植物特別是如水稻、西紅柿、擬南芥與豆類植物等氮磷元素轉(zhuǎn)運(yùn)體系基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯,氮磷代謝吸收同化途徑各種酶類表達(dá)量與活性調(diào)控,氮磷信號在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)3 暨南大學(xué)碩士

39、研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 途徑研究已經(jīng)比較成熟。米氏凱倫藻作為一種海洋浮游植物在進(jìn)化學(xué)上與這些高等植物關(guān)系相對較為親密,藻體與高等植物蛋白同源性相對其他物種較高。因此可以在高等植物氮磷吸收轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制成熟的基礎(chǔ)上研究米氏凱倫藻細(xì)胞對環(huán)境氮磷營養(yǎng)因子的響應(yīng)機(jī)理。1.4.1 植物NO ?吸收與同化代謝途徑 3氮素是蛋白質(zhì)、核酸、磷脂等植物生長發(fā)育必需的有機(jī)化合物的構(gòu)成元素,這些有機(jī)化合物都是植物活體細(xì)胞賴以生存的結(jié)構(gòu)與功能組份,因此氮素也被稱為生命的元素。由+于無機(jī)氮素在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化過程中所生成的 NH 或 NO 在植物細(xì)胞如葉片細(xì)胞積累都具有4 226毒害

40、作用 ,環(huán)境中的各種形式的無機(jī)氮,植物吸收利用率昀高的是 NO 。外界環(huán)境中的3?NO 首先經(jīng)過位于植物細(xì)胞膜上的 NO 轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)內(nèi),高等植物中存在著 3 個主要3 3?的 NO 吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體系:高親和 NO 吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(HATS)、低親和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(LATS)3 3?和雙親和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(DATS) ,當(dāng)生長介質(zhì)中 NO 濃度較低時,根系吸收 NO 主要依3 327賴于 HATS,當(dāng)生長介質(zhì)中 NO 濃度高于 1mmol/L是主要依賴于 LATS 。NO 在細(xì)胞質(zhì)3 3內(nèi)首先在硝酸鹽還原酶(NR)的催化下,以 NADH 或 NADPH 為電子供體被還原成 NO ,2+然后 NO 在

41、亞硝酸鹽還原酶(NiR)催化下被還原為 NH ,該反應(yīng)在根細(xì)胞中的電子供體2 428為 NADH或 NADPH,在葉肉細(xì)胞中則是以鐵氧還蛋白(ferredoxin, Fd)為電子供體 。+NH 與谷氨酸在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)催化下生成谷氨酰胺。谷氨酰4胺與 -酮戊二酸在谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamine-oxoglutarate amino transferase, GOGAT)的催化下,以 2 分子還原型鐵氧還蛋白(Fd )為電子供體反應(yīng)形成 2 分子谷氨red酸,谷氨酸上的氨基可以通過各種轉(zhuǎn)氨酶的作用形成 -酮戊二酸和對應(yīng)的各種氨

42、基酸(如天冬氨酸 Asp 等) ,從而進(jìn)入氨基酸循環(huán)。同時在氮同化過程中形成的 -酮戊二酸既可以作為 GS/GOGAT 循環(huán)中氨基受體,自身也是 TCA 循環(huán)中的重要成員,從而溝通了碳氮代謝。1.4.2 植物NO ?信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及氮脅迫響應(yīng) 3Crawford于 1998年提出了 NO ?既可作為植物生長的營養(yǎng)物質(zhì)又可作為信號調(diào)節(jié)植物329生長發(fā)育 。NO ?作為信號可以調(diào)節(jié)氮代謝過程中一些關(guān)鍵酶的基因轉(zhuǎn)錄與翻譯,同時也3可以通過控制細(xì)胞內(nèi)的氮代謝酶蛋白修飾而調(diào)節(jié)其催化活性。此外 NO ?作為信號可以誘3導(dǎo)糖代謝途徑有機(jī)酸代謝水平的變化。從而在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間發(fā)生交叉,形成信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。對于 NO

43、?的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與感受,植物體內(nèi)存在一系列級聯(lián)雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系。典型34 暨南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 的雙組分體系由兩部分組成:感受組氨酸激酶(sensory histidine kinase)和反應(yīng)調(diào)節(jié)子(response regulator)。以蛋白質(zhì)之間磷酸化狀態(tài)的轉(zhuǎn)移發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。NO ?信號通3過包括雙組分轉(zhuǎn)導(dǎo)體系在內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)可以影響高等植物的碳同化過程以及根部分30生組織的發(fā)育等生理過程 。培養(yǎng)在 0.2mmol/L NO ?的野生植株中硝酸鹽還原酶基因3(NIA)、亞硝酸鹽還原酶基因(NII)、谷氨酰胺合成酶(GLN1)

44、和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)的轉(zhuǎn)錄水平低,但 ADP-葡萄糖磷酸酶(AGPS2)大亞基的轉(zhuǎn)錄水平卻比27培養(yǎng)在 12mmol/L NO ?條件下的高 。 31.4.3 植物磷吸收代謝途徑 在自然環(huán)境中磷缺乏是限制植物生長的一個非常重要的因素,磷元素是植物正常生長和代謝所必須的物質(zhì)。包括植物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用、呼吸作用和生物分子的合成等均2 3有磷元素的參與。植物吸收的磷主要是正磷酸鹽形態(tài),包括 H PO ?、HPO ?、PO ?,其2 4 4 4中以 H PO ?昀易被吸收。植物中存在高親和與低親和兩種磷的吸收機(jī)制,植物主要靠高親2 4+和磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體獲取磷元素,其能量由 H -A

45、TPase 形成的跨膜質(zhì)子濃度梯度來提供。已分離到的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)包括真菌地衣球囊霉(Glomus versiforme)的細(xì)胞跨膜磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)31-33體基因 (GVPT)、 擬南芥 AtPT1-AtPT6的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體、 衣藻的 CrPT1磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體等 。吸收進(jìn)植物細(xì)胞中的磷以兩種形式存在:有機(jī)磷和無機(jī)磷,無機(jī)磷主要以鈣、鎂和鉀等陽離子的磷酸鹽形式存在;有機(jī)磷則主要以核酸、磷脂和植素等形態(tài)存在,此外細(xì)胞內(nèi)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白以及蛋白酶的功能活性都與其自身的磷酸化狀態(tài)有關(guān)。研究表明根細(xì)胞或表皮細(xì)胞吸收的磷進(jìn)入皮層后,其中的 30%-50%在數(shù)分鐘甚至幾秒鐘內(nèi)就進(jìn)入代謝。昀先合成的有機(jī)磷是 AT

46、P,此外還有 6-磷酸葡萄糖(G6P) 、6-磷酸果糖(F6P)、1,6-二磷酸果糖27(FDP)和磷酸甘油酸(PGA)等 。根吸收的磷通過轉(zhuǎn)移到達(dá)植物的各個組織,在葉片中磷參與光合作用,將 CO 轉(zhuǎn)化為葡萄糖,進(jìn)而合成蔗糖和淀粉,同時在光合磷酸化作用2中,形成 NADPH 和 ATP,其中 NADPH 是 NO ?同化所必需的。磷促進(jìn)糖從葉綠體中運(yùn)輸3出來,以磷酸酯的形式(如蔗糖磷酸酯)運(yùn)送到植物體的各個部分。蔗糖或淀粉在磷酸化酶的催化下分解為葡萄糖,參與葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)的酵解(glycolysis)的許多酶類都受到細(xì)胞磷含量水平以及自身磷酸化的調(diào)節(jié)。生成的 6-磷酸葡萄糖(G6P)可以通過戊

47、糖磷酸途徑形成核糖-5-磷酸,參與幾種核苷酸的生成,進(jìn)而脫氧形成脫氧核苷酸,參與核酸與脫氧核酸的合成。5 暨南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 1.4.4 植物磷脅迫響應(yīng)機(jī)制 植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與液泡是植物細(xì)胞的重要磷庫。在養(yǎng)分充足時,液泡一般可容納細(xì)胞內(nèi)磷總量的 85%-95%。這個庫不起代謝作用,而是緩沖因環(huán)境中磷水平的瞬間波動而引27起的胞質(zhì)內(nèi)磷的波動 。在環(huán)境磷缺乏而引起胞質(zhì)磷匱乏時,液泡膜對磷的通透性增加,液泡中的磷釋放到胞質(zhì)中,只有當(dāng)液泡中的磷完全耗盡時,胞質(zhì)中的磷水平才開始下降,34并伴隨各種缺磷挽救機(jī)制 。植物磷饑餓可快速誘導(dǎo)磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)

48、錄激活,使細(xì)胞膜上磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體數(shù)量增多,轉(zhuǎn)運(yùn)體對磷酸鹽的親和力提高,同時細(xì)胞質(zhì)膜對磷的通透性降低35以減少滲漏到環(huán)境中磷的數(shù)量 。在磷脅迫下,高等植物中普遍發(fā)生酸性磷酸酶(APase)活性增強(qiáng),植物 APase能夠釋放磷酸鹽和土壤中難溶礦質(zhì)中的磷,從而提高環(huán)境中的磷含量,另外酸性磷酸酶能水解植物體內(nèi)的磷脂化合物(如磷酸膽堿),加快磷代謝循環(huán),以36彌補(bǔ)外源性磷源的供應(yīng)不足 。缺磷抑制光合作用可通過三個方面進(jìn)行:對類囊體中電子傳遞的直接作用;對卡爾文循環(huán)幾種關(guān)鍵酶的抑制;通過類囊體膜兩側(cè)的 pH 梯度27或電子載體的氧化還原狀態(tài)的反饋抑制 。磷匱乏影響葉綠體的光能轉(zhuǎn)換和利用。研究表明低磷處理使玉

49、米葉片中 PS過度還原,PS關(guān)閉程度顯著增加,激發(fā)光通過 PS進(jìn)入37光化學(xué)過程的量顯著減少,光能轉(zhuǎn)換效率降低,過剩激發(fā)能增加 。同時缺磷也阻礙了由磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行的基質(zhì)內(nèi)磷酸丙糖的輸出,導(dǎo)致葉綠體中磷酸丙糖積累,而不能使植物同化物質(zhì)進(jìn)行有效分配,從而影響作物生長。磷缺乏使糖酵解途徑中的一些關(guān)鍵酶的活性受到影響,Stephen 等的研究表明不依賴磷與腺苷酸的胞質(zhì)酶磷酸果糖轉(zhuǎn)移酶(PFP)在磷脅迫條件下可取代正常狀態(tài)下磷酸果糖激酶(PFK)所催化的由果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-二磷酸的反應(yīng);磷獨(dú)立的非磷酸化的 NADP-3-磷酸甘油醛脫氫酶(NADP-G-3PDH)在磷缺乏時可取代正常狀態(tài)下磷

50、酸化 NAD-3-磷酸甘油醛脫氫酶(NAD-G-3PDH,)催化的由 3-磷酸甘油醛生成 1,3-二磷酸甘油酸的過程;另外磷饑餓使黑芥懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)磷酸酶,并催化由磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸的過程,而在磷充足情況下該反應(yīng)由丙酮酸激酶(PK)催化進(jìn)行。據(jù)此,Stephen 等提出了磷饑餓的糖酵解支路(包括 3 個旁路) ,具體如圖 1 所示。 此外磷的虧缺造成體內(nèi)磷、ATP、ADP、2,6-二磷酸果糖和可溶性蛋白含量降低,而游38離氨基酸含量提高 6 倍 。在嚴(yán)重缺磷的情況下 RNA 則成了可利用磷源的一個重要來源。在缺磷的西紅柿細(xì)胞中,大量的胞內(nèi)、胞外核糖核酸酶(R

51、Nase)被誘導(dǎo)產(chǎn)生,RNase 催39化的 RNA分子降解可產(chǎn)生幾種化合物,尤其是磷,有助于缺磷植物的生存 。 另外,植物中磷營養(yǎng)與硝酸鹽的吸收、共生固氮作用緊密相關(guān)。缺磷豆科植物中硝酸6 暨南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 環(huán)境氮磷因子對米氏凱倫藻分子生態(tài)學(xué)特征的影響研究 鹽的吸收顯著減少,吸收的硝酸鹽從根到莖的轉(zhuǎn)運(yùn)也減少。這有可能是磷脅迫下莖中氨基40酸的積累引起的反饋抑制的緣故 。 ATP ADP ATPADP葡萄糖-6-磷酸 果糖-6-磷酸 葡萄糖 果糖-1,6-二磷酸己糖激酶 磷酸葡萄糖 磷酸果糖激酶異構(gòu)酶 (PFK) 磷酸果糖轉(zhuǎn)移酶(PFP) PiPPi ATP ADP NADNADH果

52、糖二磷酸 醛縮酶 3-磷酸甘油醛 1,3-二磷酸甘油酸 3-磷酸甘油酸 2-磷酸甘油酸磷酸化NAD-3-磷酸甘油醛 3-磷酸甘油酸激酶脫氫酶(NAD-G-3PDH) (3-PGA) 非磷酸化的NADP-3磷酸甘油醛 脫氫酶(NADP-G-3PDH) NADP NADPHADP ATP丙酮酸激酶 (PK) 丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸 磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)磷酸酶 PiH2O圖 1 糖酵解及磷饑餓的糖酵解支路(Stephen et al. 1989) Fig.1 Glycolysis and phosphorous starvation bypass of glycolysis 實線為正常條件下的糖酵解途徑,虛線表示3個磷脅迫條件下的糖酵解支路1.5 海洋藻類分子生物學(xué)研究進(jìn)展 由于擬南芥(Arab