核磁共振光譜分析法在藥物分析中的應(yīng)用

1、核磁共振光譜分析在藥物分析中的應(yīng)用摘要對(duì)科學(xué)產(chǎn)生最大影響的分析方法是核磁共振技術(shù)，它被廣泛用于許多領(lǐng)域。本文結(jié)合核磁共振及核磁共振光譜法的相關(guān)概念，介紹核磁共振光譜分析法的特點(diǎn)及其方法，著重于核磁共振光譜分析在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用。核磁共振法以其重現(xiàn)性好、特征性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已成為藥物研究的重要手段。隨著天然藥物生產(chǎn)領(lǐng)域的發(fā)展，核磁共振作為質(zhì)量控制的手段已得到重視，并逐漸地應(yīng)用于實(shí)踐。相信不久的將來(lái)，核磁共振技術(shù)將會(huì)更好地為人類服務(wù)，為藥物研究作出貢獻(xiàn)。AbstractIn science the biggest impact on the analysis method is NMR, it is

2、 widely used in many fields. Based on the nuclear magnetic resonance (NMR) and magnetic resonance spectroscopy ,this article introduce nuclear magnetic resonance spectroscopy analysis of characteristics and methods and focusing on nuclear magnetic resonance spectraanalysis in vivo drug analysis in a

3、pplication. As natural drug production fields of development, nuclear magnetic resonance (NMR) as quality control means has been seriously, and gradually applied in practice. Nuclear magnetic resonance (NMR)technology will better service to humanity, for drug research to contribute in the future.關(guān)鍵詞

4、: 核磁共振 核磁共振光譜法 定量分析法 藥物分析Keywords: nuclear magnetic resonance nuclear magnetic resonance spectroscopy quantitative analysis method drug analysis正文：1945年，F(xiàn)Bloch和EMPurcell分別領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)小組幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)了核磁共振(NuelearMagnetic Resonance，簡(jiǎn)稱NMR)現(xiàn)象。NMR技術(shù)最初只應(yīng)用于物理科學(xué)領(lǐng)域，但隨著超導(dǎo)技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)和脈沖傅立葉變換波譜儀的迅速發(fā)展，今天核磁共振已成為鑒定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)和研究化學(xué)動(dòng)力學(xué)等

5、諸多領(lǐng)域中極為重要的方法，而且其應(yīng)用領(lǐng)域正在逐步擴(kuò)大。核磁共振技術(shù)在藥物檢驗(yàn)分析中的應(yīng)用已有多年，由于其具有其他方法難以比擬的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，即定性測(cè)定不具有破壞性、定量測(cè)定不需要標(biāo)樣，因此核磁共振技術(shù)在藥物分析中應(yīng)用和發(fā)展也越來(lái)越廣泛。核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance）原是一種原子核的物理現(xiàn)象，它的原理可以用一個(gè)不嚴(yán)格的簡(jiǎn)單模型來(lái)說(shuō)明：用最簡(jiǎn)單的原子核氫核為例，氫原子核是一個(gè)帶正電的質(zhì)子，同時(shí)原子核具有自旋性，從古典電磁學(xué)的觀點(diǎn)看來(lái)，這個(gè)自旋的帶電質(zhì)子將具有磁性，我們不妨把它暫時(shí)看成是個(gè)小磁鐵。如果我們外加一個(gè)磁場(chǎng)，小磁鐵在磁場(chǎng)中的不同方位與外加磁場(chǎng)產(chǎn)生不同的作用力，

6、如圖一a是較穩(wěn)定的狀態(tài)，圖一b則是較不穩(wěn)定的狀態(tài)。也就是說(shuō)，小磁鐵在外加磁場(chǎng)中有了兩種不同的位能狀態(tài)，兩者之間能量的差別要看外加磁場(chǎng)的大小，外加磁場(chǎng)愈大，這個(gè)能量差就愈大。圖一中a,b的兩種情形，正好對(duì)應(yīng)質(zhì)子相反方向的兩種自旋所產(chǎn)生的磁距，在未加外磁場(chǎng)時(shí)，這兩種方向的自旋沒(méi)有位能的差別，一旦加上外磁場(chǎng)，就有兩種不同的能量狀態(tài)了。這個(gè)道理可以應(yīng)用于其它更復(fù)雜的原子核，只要原子核具有自旋，在外加磁場(chǎng)中就會(huì)分出不同能量的狀態(tài)，只是有些核子能量的分歧更復(fù)雜罷了。再回到氫原子核，在磁場(chǎng)中既有兩種能量狀態(tài)，則核子在這兩個(gè)能階上的分布就不會(huì)一樣，低能階上的分布要比高能階上的分布多一點(diǎn)，這是自然的定律。如果我

7、們這時(shí)在垂直于磁場(chǎng)的方向照射一種電磁波，其頻率為，其能量為h（h是蒲郎克常數(shù)），使得h正好等于上述兩個(gè)能階的差，這時(shí)兩能階間就會(huì)有核子遷移的現(xiàn)象發(fā)生，其凈結(jié)果是，處于低能階上較多的核子吸收了h的能量達(dá)到高能階。這個(gè)現(xiàn)象就是核磁共振。另外，核磁共振光譜法是利用10100nm波長(zhǎng)的電磁波照射分子，使之與暴露在強(qiáng)磁場(chǎng)中的一定原子核互相作用，并且在某些特定磁場(chǎng)強(qiáng)度處產(chǎn)生強(qiáng)弱不同的吸收信號(hào)，以此而建立的有機(jī)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析方法?？捎糜谟袡C(jī)化合物的結(jié)構(gòu)分析、定量分析、分子量測(cè)定等方面。對(duì)中藥化學(xué)成分的研究具有重要意義。下面，介紹一下核磁共振光譜法在藥物分析中的應(yīng)用。（一）特點(diǎn)：1、對(duì)于確定的核（質(zhì)子），其信號(hào)

8、強(qiáng)度與產(chǎn)生該信號(hào)的核（質(zhì)子）的數(shù)目成正比，而與核的化學(xué)性質(zhì)無(wú)關(guān)。2、利用內(nèi)標(biāo)法或相對(duì)比較法，分析混合物中某一化合物時(shí)可無(wú)需該化合物的純品作對(duì)照。3、信號(hào)峰的寬度很窄，遠(yuǎn)小于各信號(hào)之間的化學(xué)位移的差值，因而混合物中不同組分的信號(hào)之間很少發(fā)生明顯的重疊。4、方法簡(jiǎn)易快速、專屬性高，可選擇性地測(cè)定復(fù)方藥物或藥物制劑中的組分乃至藥物的立體異構(gòu)體；一般無(wú)需分離，且不破壞被測(cè)樣品。（二）定量分析方法：NMR圖譜中，可獲得化學(xué)位移、偶合常數(shù)、共振峰面積或峰高?；瘜W(xué)位移和偶合常數(shù)是結(jié)構(gòu)測(cè)定的重要參數(shù)；而共振峰面積或峰高是定量分析的依據(jù)。共振峰面積或峰高直接與被測(cè)組分的含量成正比。定量分析時(shí)，一般只對(duì)該化合物中

9、某一指定基團(tuán)上質(zhì)子引起的峰面積或峰高與參比標(biāo)準(zhǔn)中某一指定基團(tuán)上質(zhì)子引起的峰面積進(jìn)行比較，即可求出其絕對(duì)含量。當(dāng)分析混合物時(shí)，也可采用其各個(gè)組分的各自指定基團(tuán)上質(zhì)子產(chǎn)生的吸收峰強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)比較，然后求得相對(duì)含量。因此，在測(cè)量峰面積或峰高以前，必須了解化合物的各組成基團(tuán)上質(zhì)子所產(chǎn)生共振峰的相應(yīng)位置，也就是它們的化學(xué)位移值（值），并選擇一個(gè)合適的峰作為分析測(cè)量峰。常用的NMR定量分析方法有：1、內(nèi)標(biāo)法（絕對(duì)測(cè)量法）：在樣品溶液中，直接加入一定量?jī)?nèi)標(biāo)物質(zhì)后，進(jìn)行NMR光譜測(cè)定。將樣品指定基團(tuán)上的質(zhì)子引起的共振峰（即吸收峰）面積與由內(nèi)標(biāo)物質(zhì)指定基團(tuán)上的質(zhì)子引起的共振峰面積進(jìn)行比較，當(dāng)樣品與內(nèi)標(biāo)均經(jīng)精密稱

10、重時(shí)，則樣品的絕對(duì)重量(Wu)可由下式求得：Wu/Ws=Au·EWu/ As·EWs Wu=Ws·Au·EWu/ As·EWs 式中：Au為樣品測(cè)得和峰面積（不少于5次測(cè)定的平均值）；As為內(nèi)標(biāo)物測(cè)得的峰面積（不少于5次測(cè)定的平均值）；EWu為樣品在該化學(xué)位移處的質(zhì)子當(dāng)量；EWs為內(nèi)標(biāo)在該化學(xué)位移處的質(zhì)子當(dāng)量。若樣品重為W，則百分含量=Wu/W ×100%對(duì)內(nèi)標(biāo)物要求：(1)最好能產(chǎn)生單一的共振峰，在掃描的磁場(chǎng)區(qū)域中，參比共振峰與樣品峰的位置至少有30Hz的間隔；(2)應(yīng)溶于分析溶劑中；(3)應(yīng)有盡可能小的質(zhì)子當(dāng)量(EWs)；(4)不

11、應(yīng)與樣品中任何組分相互作用。 常用的內(nèi)標(biāo)物有：苯或苯甲酸芐酯（在5.3ppm處，由C6H5COOCH2-C6H5中的-CH2所致），適用于非芳香化合物；馬來(lái)酸，適用于非鏈烯型化合物。2、相對(duì)測(cè)量法：當(dāng)不能獲得樣品的純品或合適的內(nèi)標(biāo)時(shí)，可用相對(duì)測(cè)量法進(jìn)行分析。操作方法與內(nèi)標(biāo)法相同。計(jì)算相對(duì)含量是以樣品指定基團(tuán)上一個(gè)質(zhì)子引起的吸收峰面積(A1/n1)和雜質(zhì)指定基團(tuán)上一個(gè)質(zhì)子引起的吸收峰面積(A2/n2)進(jìn)行比較，然后按下式計(jì)算樣品與該雜質(zhì)的相對(duì)百分含量：樣品的相對(duì)百分含量=(A1/n1/(A1/n1)+(A2/n2)×100%式中，n1和n2是指定基團(tuán)的質(zhì)子數(shù)。 本法適用于含有一、二種雜

12、質(zhì)的樣品的分析。3、外標(biāo)法：欲測(cè)樣品中某一組分的含量，可采用該組分的標(biāo)準(zhǔn)品做成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，使樣品液濃度在其范圍內(nèi)，然后進(jìn)行NMR測(cè)定，由所得圖譜中某一指定基團(tuán)上質(zhì)子引起的峰面積對(duì)濃度作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)品的校正曲線。在平行條件下，測(cè)定樣品溶液組分指定基團(tuán)上質(zhì)子的峰面積，即可由校正曲線求得樣品的濃度。4、峰高或峰位測(cè)量法：結(jié)構(gòu)相似的混合物樣品（如互為異構(gòu)體），由于其NMR峰分離效果不好，用峰面積定量法不能精確測(cè)定，誤差較大，此時(shí)可考慮采用峰高測(cè)量法或峰位測(cè)量法。(1)峰高測(cè)量法：是基于峰高與樣品中有關(guān)核的濃度成正比，各組分之間的峰高比只取決于樣品的百分組成，而與樣品的多少和儀器的性能無(wú)關(guān)。

13、測(cè)定某一對(duì)異構(gòu)體時(shí)，先用異構(gòu)體I和II的純品配成溶液，再用質(zhì)子快速交換簡(jiǎn)化光譜。由簡(jiǎn)化的NMR光譜可知兩異構(gòu)體的吸收峰互不干擾；可測(cè)出各自峰高。兩者摩爾數(shù)MI+MII=1，若兩者的峰高為HI和HII，則：HI=MI×CI=（1-MII）CI ；HII=MII×CII ；兩式中，CI和CII是異構(gòu)體I和II的峰高系數(shù)，為已知，HI和HII可測(cè)得。據(jù)此可求得MI和MII。(2)峰位測(cè)量法：當(dāng)樣品中兩種組分之間具有可進(jìn)行質(zhì)子快速交換的基團(tuán)時(shí)，經(jīng)質(zhì)子快速交換后，原來(lái)兩種組分基團(tuán)的信號(hào)合并，在NMR光譜上得到單一信號(hào)，此峰的化學(xué)位移與兩組分的摩爾分?jǐn)?shù)有線性關(guān)系，因此，測(cè)出混合物的化學(xué)

14、位移，可直接求出二組分的混合比例。如有機(jī)胺及其鹽的N-CHa上的質(zhì)子可以進(jìn)行質(zhì)子快速交換，可用NMR法定量測(cè)定有機(jī)胺酸性水溶液的氯仿提取液中游離胺及其鹽的比例。混合物中N-CHa的化學(xué)位移(m)可按下式計(jì)算：m= b+( a- b)Xa 式中 b和 a為純的游離胺及其鹽的化學(xué)位移，Xa為鹽的摩爾分?jǐn)?shù)。以 m對(duì)Xa或Xb（游離胺的摩爾分?jǐn)?shù)）作圖，應(yīng)呈直線關(guān)系。因此可先用純品配成已知組成比例的混合物，測(cè)得其 m并作出校正曲線后，再測(cè)得未知混合物的 m，即可由校正曲線求得Xa或Xb。下面介紹核磁共振光譜在體內(nèi)藥物分析的應(yīng)用體內(nèi)藥物分析是對(duì)生物體內(nèi)藥物及其代謝物的分析。由于體內(nèi)樣品有這樣一些特點(diǎn)：藥物

15、及其代謝物在大量的體液中濃度很低；存在著內(nèi)源性干擾物質(zhì)；取樣量受限制；樣品具有不重復(fù)性。而NMR在體內(nèi)藥物分析中具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，即簡(jiǎn)便性、無(wú)損傷性、連續(xù)性、高分辨性和多目標(biāo)性，因此其在體內(nèi)藥物分析中有較廣泛的應(yīng)用33。MRS能檢測(cè)含H、P、C、F、Na等生化物質(zhì)的代謝變化H1。，其中以H、c、F、P應(yīng)用最多。質(zhì)子(H)磁共振波譜多用于監(jiān)測(cè)與脂肪、氨基酸及神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)的多種微量代謝物，臨床研究中能觀測(cè)到的有N一乙酰天門(mén)冬氨酸、含膽堿的化合物、肌酸、肌醇、乳酸和磷酸肌酸等。(1)N一乙酰天門(mén)冬氨酸(Nacetylaspartate，NAA)主要存在于神經(jīng)元中，是目前公認(rèn)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性的標(biāo)志物，

16、NAA降低提示神經(jīng)元缺失，受損或功能活動(dòng)異常。但是Bhakoo等發(fā)現(xiàn)成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)NAA，可能就是HMRS中的202ppm的信號(hào)。(2)含膽堿的化合物(cholinecontmning compounds，CHO)為磷酸脂代謝產(chǎn)物，在腦形成髓鞘過(guò)程中被用來(lái)合成磷脂，主要存在于細(xì)胞膜上，反映細(xì)胞膜的合成及代謝變化。(3)肌酸和磷酸肌酸(creatine andphos2phocreatine，Cr+PCr)存在于神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中，參與磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)及能量?jī)?chǔ)備，受高能磷酸酯的代謝影響。在HMRS研究中，因?yàn)槠錆舛认鄬?duì)穩(wěn)定，多作為其他物質(zhì)濃度的參照，但對(duì)此也有不同看法。Chang等就發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀

17、的重度可卡因?yàn)E用者的顳頂葉白質(zhì)cr顯著升高，而NAA正常。(4)肌醇(myoinositol，MI)主要存在于膠質(zhì)細(xì)胞中，被認(rèn)為是膠質(zhì)細(xì)胞特異性的標(biāo)志物，其濃度增加提示膠質(zhì)細(xì)胞增生。細(xì)胞外滲透壓增高亦導(dǎo)致MI升高。谷氨酰胺和谷氨酸復(fù)合物(glutamine，glutamate，GLX)，前者主要存在于膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，后者是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，主要位于谷氨酸能神經(jīng)元內(nèi)。(5)乳酸(1actare，Lac)為糖酵解的主要代謝產(chǎn)物，可反映無(wú)氧酵解的情況，是組織供氧不足的標(biāo)志¨1。碳13(c)核天然豐度低，其譜峰強(qiáng)度僅為質(zhì)子峰的163，因而CNMR靈敏度遠(yuǎn)低于氫譜。NMR的迅速發(fā)展將信號(hào)累加平均

18、(CAT)、質(zhì)子噪聲去偶、偏共振去偶、PFr、NOE、DEPT等新技術(shù)與CNMR結(jié)合，使CNMR也能用于體內(nèi)藥物分析。CNMR一大特點(diǎn)為化學(xué)位移范圍很寬(約300ppm)，相當(dāng)于氫譜化學(xué)位移范圍的20倍。因此不同化學(xué)環(huán)境的c共振峰重疊機(jī)會(huì)甚少，分辨率優(yōu)于氫譜，實(shí)踐中常將二者互補(bǔ)使用。已報(bào)道過(guò)用CNMR研究布洛芬、雷尼替丁枸櫞酸鉍、脫氧青蒿素的體內(nèi)過(guò)程。Ogiso等用CNMR探討了脂肪酸對(duì)普萘洛爾透皮吸收的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與月桂酸酰胺及甲酯化合物相比，月桂酸對(duì)普萘洛爾透皮吸收的增強(qiáng)作用顯著。普萘洛爾制劑中加入月桂酸后，血漿中普萘洛爾濃度明顯提高。Copeland等用cNMR和1HNMR共同確

19、認(rèn)了免疫抑制劑環(huán)孢霉素G的兩種代謝途徑：羥基化和去甲基化¨。其代謝物藥理活性均低于原型藥。氟一19核磁共振波譜(FNMR)在體內(nèi)藥物分析中可檢測(cè)濃度高于10 mol，ml、化學(xué)位移范圍在一20ppm一50ppm的含氟藥物及其代謝物。對(duì)于單氟原子藥物譜圖中每一組峰即代表一種含氟物質(zhì)。FNMR對(duì)傳統(tǒng)生物樣品中藥物的研究已有許多報(bào)道，如尿樣中氟氯西林代謂研究；尿樣、肝臟、腫瘤中5一氟尿嘧啶(5一Fu)代謂及5一FU灌流心臟的心臟毒性研究；尿樣中氟比洛芬代謝途徑歸屬等。Tandon等用FNMR對(duì)小鼠腹腔注射抗病毒藥物三氟胸苷(F3TdR)后的尿樣、血漿、肝臟進(jìn)行分析，檢測(cè)出三種代謝物：52三

20、氟胸腺嘧啶(F3T)(1202ppm)、5一三氟甲基一5，6一二氫胸腺嘧啶(DHF3T)(8119ppm)和5一三氟甲基一5，6一雙羥基胸腺嘧啶(DOHF3T)(一053ppm)。其中后兩種代謝物為首次檢測(cè)，這就為F3TdR的體內(nèi)過(guò)程提供了進(jìn)一步的解釋。近年來(lái)NMR譜技術(shù)發(fā)展到對(duì)整體生物系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)藥物分布、代謝監(jiān)測(cè)。由于內(nèi)源性含氟物質(zhì)的濃度極低，背景干擾小，使FNMR優(yōu)于其它磁核譜技術(shù)而首先應(yīng)用于整體生物分析Murphy等用質(zhì)子去偶及NOE增益FNMR監(jiān)測(cè)接受化療病人的肝臟中5一FU及其代謝物(FBAL)。Campbell等利用NMR無(wú)損傷特性及表面線圈技術(shù)，測(cè)定了不同劑量抗菌素3一氟甲基青

21、霉索V衍生物在活體sD大鼠體內(nèi)的藥物濃度。將靜脈注藥后的麻醉鼠置于表面線圈中，用FNMR測(cè)定鼠膀胱內(nèi)尿樣及胸內(nèi)藥物濃度。Jynpe等用FNMR分析了給藥后24h內(nèi)抗菌素氟羅沙星在正常人肝臟及肌肉中的分布。上述研究為無(wú)損傷測(cè)定生物活體內(nèi)藥物提供了例證，且為藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了一種動(dòng)態(tài)測(cè)定研究的方法。磷一31磁共振波譜(PMRS)被廣泛用于研究組織能量代謝和生化改變，可監(jiān)測(cè)7種不同的化合物：磷酸單酯(phosphomonoesters，PME)，磷酸二酯(phosphodiesters，PDE)，磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)，無(wú)機(jī)磷(inorganicphosphate，Pi)，三磷酸腺苷(儀，B，一adenosine triphosphates，0l，B，1一ATP)。PME和PDE反應(yīng)了膜磷脂及其代謝信息，PCr、Pi、_僅，B，1一ATP可提供高能磷酸代謝信息。 核磁共振法以其重現(xiàn)性好、特征性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已成為藥物研究的重要手段。隨著天然藥物生產(chǎn)領(lǐng)域的發(fā)展，核磁共振作為質(zhì)量控制的手段已得到重視，并逐漸地應(yīng)用于實(shí)踐。總之，核磁共振無(wú)疑會(huì)給天然藥物研究帶來(lái)巨大的推動(dòng)作用。 參考文獻(xiàn)：1 馮敏NMR技術(shù)在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用藥學(xué)進(jìn)展1998，4142 王大志等核磁共振波譜在天然藥物領(lǐng)域中的應(yīng)用首都醫(yī)藥 2004