逆流色譜的技術-2013.

1、逆流色譜技術與應用主講: 魏蕓*逆流色譜定義、特點*逆流色譜技術的歷史*逆流色譜的原理*逆流色譜儀器*逆流色譜分離實施操作*逆流色譜技術新進展*逆流色譜的應用舉例*逆流色譜的發(fā)展前景什么是逆流色譜？ 逆流色譜 （Counter-Current Chromatography，CCC）是一種基于多級逆流液液萃取的分析及制備色譜。溶質依靠在離心力場下空心螺旋管中逆向流動的兩個不相混溶液體間溶質分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)分離。得到的譜圖通常是一些各溶質相互分離的譜峰。這種色譜不需要通常色譜中的固體固定相。用保留于空心管內的一相作固定相，另一相液體作流動相。逆流色譜的特點逆流色譜的特點不用任何固態(tài)支持體，實現(xiàn)

2、純粹的高效液-液分配分離。*完全排除支持體對樣品的不可逆吸附、沾染、失活、變性等影響。*節(jié)省材料和溶劑。*能實現(xiàn)較大制備量的高純度物質分離純化。逆流色譜技術的歷史1950s逆流分溶法Countercurrent Distribution （CCD）1960s液滴逆流色譜Droplet Countercurrent Chromatography (DCCC)1966Ito赴美國NIH開發(fā)螺旋管逆流色譜技術1970s建立Coil Planet Contrifuge（CPC）實現(xiàn)逆流色譜技術的基本模型。并應用于抗生素、肽、氨基酸等類物質的分離。1980s發(fā)明正交軸CCC，高速逆流色譜（HSCCC）小

3、量分析型HSCCC等原型。1990sHSCCC技術在世界范圍內傳播，J. C., J. L. C. 連續(xù)出版多次專輯。1995建立pH區(qū)帶CCC體系，F(xiàn)DA用來制備有機染料標準樣品。1995美國化學會出版Modern CCC一書1996美國John Wiley & Sons Co.出版HSCCC一書。被選編為分析化學叢書132卷。20009月在英國Brunel大學召開第一屆國際CCC技術學術會議CCC2000。并決定CCC2002在中國召開。十卷巨著Encyclopedia of Separation Science（分離科學百科叢書）由Academic Pree Ltd（英國科學出版

4、社）出版發(fā)行。2000年我國張教授應邀撰寫了關于HSCCC分離天然產物中生物堿、黃酮等類物質的條目。逆流色譜的原理Principle of CCC 單向性流體動力學平衡理論單向性流體動力學平衡理論高速逆流色譜的單向流體動力平衡機理高速逆流色譜的單向流體動力平衡機理 J J型行星式運動螺旋管內兩相溶劑混合和移動型行星式運動螺旋管內兩相溶劑混合和移動 逆流色譜有什么優(yōu)點？一、沒有固體載體空心管代替了填料柱；相應地，溶劑體系選擇代替了分離柱選擇。由于不用固體支撐體，避免了樣品在分離過程的不可逆吸附、分解等可能的樣品變性問題二、收率高理論收率為 100滯留在柱中的樣品可以通過多種洗脫方式予以完全回收三

5、、高效能單個物質的基線分離粗樣可以直接上樣而不會對柱子造成任何損害；柱子可以用合適的溶劑（如甲醇）很容易地清洗，然后注入新的溶劑后構成新的柱體，重復使用。四、工作條件溫和基本上是常溫低壓（液體定量泵的壓力）的液相操作五、用途廣，適應能力強原則上，凡能進行萃取分離的體系，都能用逆流色譜法分離幾乎任何互不相溶的兩相溶劑系統(tǒng)都可以使用，只是有的溶劑體系可能在一些特殊型號的HSCCC儀器上可以取得更好的分離效果。因此，可以通過改變溶劑體系的極性，實現(xiàn)對不同極性物質的分離。六、有制備能力全球科學工作者正為之努力；已有幾個方案；已有樣機，可達工業(yè)規(guī)模；近兩年更加完善。逆流色譜的能力如何？按規(guī)模大小可分為三

6、 種 類 型1、分 析 型320分鐘給出全譜2、半 制 備 型 轉鼓容量200300毫升。每輪操作能給出產品5100毫克，適于克量級制備。3、制 備 型公斤級或公斤級以上的制備。 高速逆流色譜分離實施操作高速逆流色譜分離實施操作SampleInjectorMultilayerCoil PlanetCentrifugeDetectorPump SolventReservoirFractionCollectorRecorderor PCHPLC,TLCMS, NMR AnalysisHSCCC Separation SystemUV, ELSD, MSHSCCC Separation System

7、1. 溶劑系統(tǒng)的準備溶劑系統(tǒng)的準備HSCCC分離的溶劑系統(tǒng)，應該滿足以下要求：l 不造成樣品的分解與變性；l 足夠高的樣品溶解度；l 樣品在系統(tǒng)中合適的分配系數(shù)值；l 固定相能實現(xiàn)足夠高的保留。 高速逆流色譜常用基本溶劑體系高速逆流色譜常用基本溶劑體系 高速逆流色譜常用基本溶劑體系 被分離物質種類 基本兩相溶劑系統(tǒng) 輔助溶劑 非極性或弱極性物質 正庚(己)烷甲醇 正庚(己)烷乙腈 正庚(己)烷甲醇(或乙腈)水 氯烷烴 氯烷烴 中等極性物質 氯仿水 乙酸乙酯水 甲醇，正丙醇，異丙醇 正己烷，甲醇，正丁醇 極性物質 正丁醇水 甲醇，乙酸 溶劑體系的平衡溶劑體系的平衡 充分地混和和靜置 使用前脫氣

8、封閉的容器來儲存 2. 柱系統(tǒng)的準備柱系統(tǒng)的準備 首先在儀器不旋轉的狀態(tài)下，以較高的流速將固定相注入螺旋管柱內；此時可同時開啟檢測器預熱； 注滿固定相后，停泵。然后使儀器以選定的轉速開始轉動； 將流動相以合適的流速泵入柱內，直到流動相開始流出，此時說明柱體系已達到平衡； 當一切包括檢測器基線都穩(wěn)定時，該柱系統(tǒng)即準備就緒，可以進樣了。3. 樣品溶液的準備和進樣樣品溶液的準備和進樣 樣品混合物可溶解在分離所用的溶劑體系中制備成樣品溶液。當樣品量較小時，可以將樣品溶解在流動相中。當樣品量較大時，可以將樣品溶解在相同體積的上相和下相中。 逆流色譜對樣品的要求不高，甚至允許有懸浮物的樣品溶液進入；進樣體

9、積可以達到柱體積的1015。 4. 洗脫方式洗脫方式 等比例洗脫等比例洗脫 階躍梯度洗脫階躍梯度洗脫 梯度洗脫梯度洗脫 雙向洗脫雙向洗脫 清洗柱體清洗柱體5. 檢測器檢測器 紫外-可見光檢測器（UV-VIS） 蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD） 質譜檢測器(MSD) 逆流色譜技術的新發(fā)展逆流色譜技術的新發(fā)展CCC New Development Chromatogram of the crude ethanol extract of Rheum officinals Baill by analytical HSCCC. Solvent system: A. n-hexane-ethyl acetat

10、e-methanol-water (9:1:5:5, v/v/v/v); B. n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (1:1:1:1, v/v/v/v); C. n- hexane-ethyl acetate-methanol-water (3:7:5:5, v/v/v/v); stationary phase: upper organic phase; mobile phase: lower aqueous phase; flow-rate: 1.0 ml/min; revolution speed: 1800rpm; sample: 15mg dis

11、solved in 1.0 ml lower phase. Peak 2 of A, B and C contains rhein. HPLC conditions: Supelcosil ODS column (250 x 4.6 mm I.D.), column temperature: 35C. Mobile phase: methanol: 0.5% H3PO4 (60:40, v/v), flow-rate: 1.0 ml/min monitored at 254nm by a PAD detector. 分析型高速逆流色譜法分離大黃粗提物中大黃酸Chromatogram of th

12、e crude ethanol extract from Rheum officinaleBaill by multidimensional countercurrent chromatography(MDCCC). Solvent system: n- hexane-ethyl acetate-methanol-water (3:7:5:5, v/v/v/v); stationary phase: upper organic phase;mobile phase: lower aqueous phase; flow-rate: 2.0 ml/min;revolution speed: 800

13、rpm; sample: 500 mg dissolved in 20 ml oflower phase. A. Chromatogram obtained by HSCCC 1 (Peak 2 ofFig. 4A contains rhein). B. Chromatogram of the cut fraction (theshaded part of the peak 2 in Fig.4 A) obtained by HSCCC 2. HPLCconditions: Supelcosil ODS column (250 x 4.6 mm I.D.), columntemperature

14、: 35C. Mobile phase: methanol: 0.5% H3PO4 (60:40,v/v), flow-rate: 1.0 ml/min monitored at 254nm by a PAD detector.柱多維高速逆流色譜法分離大黃粗提物中大黃酸雙水相逆流色譜體系3.Brief introduction of the 3.Brief introduction of the programprogramCCC2002 Beijing CHINACCC2002 Beijing CHINA離心沉降色譜Centrifugal Precipitation Chromatograp

15、hy逆流色譜應用舉例逆流色譜應用舉例Applications of CCC標準蛋白質的分離 Y. WEI, 正交軸逆流色譜雙水相溶劑pH對標準蛋白質分離的影響羊肚菌糖蛋白的分離高速逆流色譜法對天然產物小分子分離純化研究高速逆流色譜法對天然產物小分子分離純化研究 高速逆流色譜法對天然產物小分子分離純化高速逆流色譜法對天然產物小分子分離純化高速逆流色譜法制備高純度單體番茄紅素高速逆流色譜法制備高純度單體番茄紅素 分析型逆流色譜法分離番茄紅素分析型逆流色譜法分離番茄紅素Chromatogram of the crude extract from marigold petal by preparati

16、ve HSCCC. Solvent system: n-hexane-dichloromethane-acetonitrile (10:3.5:6.5/v:v:v); stationary phase: lower phase; mobile phase: upper phase; flow-rate: 1.0 ml/min; revolution speed: 1800 rpm; sample:15 mg dissolved in 1 ml lower phase; retention of the stationary phase: 62.5%. Peak:5. lycopeneY. WE

17、I, 半制備型逆流色譜法分離番茄紅素半制備型逆流色譜法分離番茄紅素Chromatogram of the crude extract from marigold petal by preparative HSCCC. Solvent system: n-hexane-dichloromethane-acetonitrile (10:3.5:6.5/v:v:v); stationary phase: lower phase; mobile phase: upper phase; flow-rate: 2.0 ml/min; revolution speed: 800 rpm; sample:20

18、0 mg dissolved in 20 ml lower phase; retention of the stationary phase: 62.5%. Peak:5. lycopene 高效液相色譜法對番茄紅素粗提物和高速逆流色譜峰所對應組分進行分析高效液相色譜法對番茄紅素粗提物和高速逆流色譜峰所對應組分進行分析 色譜條件為：柱子：Supelcosil ODS, 柱溫30C。流動相：乙腈：甲醇：氯仿=47：47：6，V/V/V，流速為1.0ml/min，檢測波長為472nm和 254nm。 粗提物番茄紅素 高速逆流色譜法對天然產物小分子分離純化高速逆流色譜法對天然產物小分子分離純化高速逆

19、流色譜法制備高純度單體葉黃素高速逆流色譜法制備高純度單體葉黃素 分析型逆流色譜法分離葉黃素分析型逆流色譜法分離葉黃素 Chromatogram of the crude extract from marigold petal by analytical HSCCC. Solvent system: a: n-heptane-chloroform-acetonitrile (10:2:8, v/v/v); b: n-heptane-chloroform-acetonitrile (10:3.5:6.5, v/v/v); c: n-heptane-chloroform-acetonitrile (

20、10:3:7, v/v/v); stationary phase: lower phase; mobile phase: upper phase; flow rate: 1.0ml/min; revolution speed: reverse revolution 1800 rpm; sample: 15mg dissolved in 1 ml upper phase; retention of the stationary phase: about 50%. Peak: 2. lutein Y. WEI, 半制備型逆流色譜法分離葉黃素半制備型逆流色譜法分離葉黃素Chromatogram of

21、 the crude extract from marigold petal by preparative HSCCC. Solvent system: n-hexane-chloroform-acetonitrile (10:3:7/v:v:v); stationary phase: lower phase; mobile phase: upper phase; flow-rate: 2.0 ml/min; revolution speed: reverse revolution 800 rpm; sample:300 mg dissolved in 20 ml lower phase; r

22、etention of the stationary phase: 62.5%. Peak:2. lutein高效液相色譜法對葉黃素粗提物和高速逆流色譜法分離得葉黃素分析高效液相色譜法對葉黃素粗提物和高速逆流色譜法分離得葉黃素分析 The result of HPLC analysis of the crude extract from marigold petal and Peak 2 (lutein) Shown in Fig.3. (A): the crude sample; (B): peak 2; Column: an Internet ODS column (150 x 4.6 m

23、m I.D.); Column temperature: 30C; The mobile phase composed of A: 100%methanol, B: 100% ethyl acetate was eluted at a flow-rate of 2.0 ml/min using linear gradient over 20 min from 60% methanol to 40% methanol and the effluent monitored at446nm and 254nm by a PAD detector. 粗提物葉黃素 高速逆流色譜法對天然產物小分子分離純化

24、高速逆流色譜法對天然產物小分子分離純化高速逆流色譜法制備高純度雷公藤乙素高速逆流色譜法制備高純度雷公藤乙素 OoHOH3COHCHCHCH33OOOFig.1 Chromatogram of tripdiolide from Tripterygium wilfordii Hook by preparative high-speed countercurrent chromatography (HSCCC) Solvent system: n- hexane-dichloromethane-methanol-water (3:22:17:8, v/v/v/v); stationary phase

25、: upper organic phase; mobile phase: lower aqueous phase; flow-rate: 2.0 ml/min; revolution speed: 800rpm; UV 214nm. Sample: 1000 mg dissolved in 20 ml of lower phase 柱多維高速逆流色譜法分離雷公藤粗提物中雷公藤乙素Y. WEI, Fig.2 Chromatogram of tripdiolide from Tripterygium wilfordiiHook by multidimensional countercurrent

26、chromatography(MDCCC)A. Chromatogram obtained by HSCCC 1. Solvent system: n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (3:22:17:8, v/v/v/v);stationary phase: upper organic phase; mobile phase: lower aqueousphase; flow-rate: 2.0 ml/min; revolution speed: 800rpm; UV 214nm.Sample: 1000 mg dissolved in 20 ml of lower phase. B.Chromatogram of the cut fraction (the shaded part of the peak 3 inFig.1) obtained by HSCCC 2. Solvent system: chloroform-methano