重組人表皮生長(zhǎng)因子凝膠(酵母) (新增)

1、重組人表皮生長(zhǎng)因子凝膠（酵母）Chongzu Ren Biaopi Shengzhangyinzi Ningjiao (Jiaomu)Recombinant Human Epidermal Growth Factor Gel（Yeast）本品系由高效表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子基因的酵母，經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后,加入凝膠基質(zhì)制成。含適宜穩(wěn)定劑，防腐劑，不含抗生素。1 基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。2 制造2.1 工程菌菌種 名稱及來(lái)源重組人表皮生長(zhǎng)因子工程菌株，系由帶有人工合成的人表皮生長(zhǎng)因子基因的DNA片段整合到酵母菌染色體基因組中構(gòu)建而成。 種子批

2、的建立應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的規(guī)定。 菌種檢定主種子批和工作種子批的菌種應(yīng)進(jìn)行以下各項(xiàng)全面檢定。.1 劃種BMG1瓊脂平板應(yīng)呈典型酵母菌菌落形態(tài)，無(wú)其他雜菌生長(zhǎng)。.2 染色鏡檢在光學(xué)顯微鏡下觀察，應(yīng)形狀規(guī)則，用次甲蘭染色，無(wú)死亡細(xì)胞。.3 篩選標(biāo)志檢查應(yīng)符合該基因表型特征。.4 人表皮生長(zhǎng)因子表達(dá)量在搖床中培養(yǎng)，應(yīng)不低于原始菌種的表達(dá)量。.5 人表皮生長(zhǎng)因子基因穩(wěn)定性檢查涂BMG1瓊脂平板，挑選至少50個(gè)克隆，用PCR檢測(cè)人表皮生長(zhǎng)因子基因，陽(yáng)性率應(yīng)不低于95。 2.2 原液 種子液制備 將檢定合格的工作種子批菌種接種于適宜的培養(yǎng)基（可含適量抗生素）中培養(yǎng)，供發(fā)酵罐接種用。

3、 發(fā)酵用培養(yǎng)基采用適宜的不含任何抗生素的培養(yǎng)基。 種子液接種及發(fā)酵培養(yǎng)在滅菌培養(yǎng)基中接種適量種子液。在適宜溫度下進(jìn)行發(fā)酵，應(yīng)采用經(jīng)批準(zhǔn)的發(fā)酵工藝，并確定相應(yīng)的發(fā)酵條件，如溫度、pH值、溶氧、補(bǔ)料、發(fā)酵時(shí)間等。 發(fā)酵液處理用適宜的方法收集上清液。 純化采用經(jīng)批準(zhǔn)的純化工藝進(jìn)行純化，使其達(dá)到3.1項(xiàng)要求，即為人表皮生長(zhǎng)因子原液。除菌過(guò)濾后保存于適宜溫度，并規(guī)定其有效期。 原液檢定按3.1項(xiàng)進(jìn)行。2.3 半成品制備采用的基質(zhì)應(yīng)符合凝膠劑基質(zhì)要求（附錄I M）。配制與除菌應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的配方進(jìn)行。凝膠制備應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的工藝進(jìn)行。凝膠劑應(yīng)均勻、細(xì)膩，在常溫時(shí)保持膠狀，不干涸或液化。2.3.3 半成品檢定按3.

4、2項(xiàng)進(jìn)行。2.4 成品 分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。 分裝應(yīng)符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。 規(guī)格應(yīng)為經(jīng)批準(zhǔn)的規(guī)格。 包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程” 和附錄M的有關(guān)規(guī)定。3 檢定3.1 原液檢定 生物學(xué)活性依法測(cè)定（附錄 H）。 蛋白質(zhì)含量依法測(cè)定（附錄 B第二法）。 比活性 為生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比，每1mg 蛋白質(zhì)應(yīng)不低于5.0×105IU。 純度.1 電泳法依法測(cè)定（附錄 C）。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15.0，加樣量應(yīng)不低于10g（考馬斯亮藍(lán)R250染色法）或5g（銀染法）。經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)不低于95.0。 .2 高效液相色譜

5、法依法測(cè)定（附錄 B）。色譜柱采用丁基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以A相（三氟乙酸-水溶液：取0.5ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻）、以B相（三氟乙酸-乙腈溶液：取0.5ml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻）為流動(dòng)相，在室溫條件下，進(jìn)行梯度洗脫（2237%B相），上樣量應(yīng)不低于5g，于波長(zhǎng)280nm處檢測(cè)，以人表皮生長(zhǎng)因子色譜峰計(jì)算理論板數(shù)，應(yīng)不低于500。按面積歸一化法計(jì)算，人表皮生長(zhǎng)因子主峰面積應(yīng)不低于總面積的95.0。 分子量依法測(cè)定（附錄 C）。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15.0，加樣量應(yīng)不低于1.0g，分子質(zhì)量應(yīng)為5.9kD+0.659kD

6、。 外源性DNA殘留量每1支應(yīng)不高于10ng（附錄 B）。3.1.7 宿主菌蛋白殘留量 應(yīng)不高于總蛋白質(zhì)的0.1%（附錄 E）。3.1.8 甲醇含量甲醇含量應(yīng)不高于0.002（附錄 C）。3.1.9 等電點(diǎn)主區(qū)帶應(yīng)為4.05.0，供試品的等電點(diǎn)與對(duì)照品的等電點(diǎn)圖譜一致（附錄IV D）。3.1.10 紫外光譜掃描用水或生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至約100g/ml500g/ml，在光路1cm、波長(zhǎng)230nm360nm下進(jìn)行掃描,最大吸收峰波長(zhǎng)應(yīng)為277±3nm（附錄 A）。3.1.11 肽圖（每半年測(cè)定一次） 依法測(cè)定（附錄 E）,應(yīng)與對(duì)照品圖形一致。 2 N-末端氨基酸序列（至少每年測(cè)

7、定一次）用氨基酸序列分析儀測(cè)定，其N-末端序列應(yīng)為：AsnSerAspSerGluCysProLeuSerHisAspGlyTyrCysLeu。3 鑒別試驗(yàn)按免疫印跡法（附錄 A）或免疫斑點(diǎn)法（附錄 B）測(cè)定，應(yīng)為陽(yáng)性。3.2 半成品檢定3.2.1 生物學(xué)活性應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的方法預(yù)處理供試品，依法測(cè)定（附錄 X H），應(yīng)符合要求。 無(wú)菌檢查應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的方法預(yù)處理供試品，依法檢查（附錄 A），應(yīng)符合規(guī)定。3.3 成品檢定除外觀、裝量檢查外，應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的方法預(yù)處理供試品后，進(jìn)行其余各項(xiàng)檢定。 鑒別試驗(yàn)按免疫印跡法（附錄 A）或免疫斑點(diǎn)法（附錄 B）測(cè)定，應(yīng)為陽(yáng)性。 物理檢查.1 外觀 應(yīng)為無(wú)色透明凝膠，無(wú)顆粒，不析水。.2 裝量依法檢查(附錄 F)，應(yīng)符合規(guī)定。3.3.3 pH值應(yīng)為6.58.0（附錄 A）。3.3.4 生物學(xué)活性應(yīng)為標(biāo)示量的