第三章 生物信息傳遞(上)—從DNA到RNA

1、第三章 生物信息傳遞（上）從DNA到RNA本章主要內(nèi)容： RNA轉(zhuǎn)錄概述； RNA聚合酶（原核、真核）*； 啟動(dòng)子（原核*、真核）； 轉(zhuǎn)錄過(guò)程（原核*、真核）； 轉(zhuǎn)錄后的加工（真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后的加工）*一、 RNA轉(zhuǎn)錄概述基因表達(dá)：包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)階段。1、轉(zhuǎn)錄(transcription)定義：以DNA為模板，在依賴于DNA的RNA聚合酶的催化下，以 4種rNTP(ATP、CTP、GTP和UTP)為原料，合成RNA的過(guò)程。RNA是DNA將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)的中心環(huán)節(jié)。在有些RNA病毒中，RNA也可以指導(dǎo)合成RNA。 轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步,也是最關(guān)鍵的一步轉(zhuǎn)錄過(guò)程涉及到兩個(gè)方面:

2、RNA合成的酶學(xué)過(guò)程是RNA合成的起始信號(hào)和終止信號(hào),也就是DNA分子上的特定序列2、原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程模板識(shí)別：RNA聚合酶與啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄：RNA鏈上 第一個(gè)核苷酸鍵的產(chǎn)生。通過(guò)啟動(dòng)子：RNA聚合酶形成9個(gè)核苷酸短鏈后離開(kāi) 啟動(dòng)子區(qū)。轉(zhuǎn)錄的延伸：在DNA一條鏈上通過(guò)堿基配對(duì)合成RAN鏈，解鏈區(qū)沿DNA移動(dòng)，每秒合成5090個(gè)核苷酸。轉(zhuǎn)錄的終止：終止位點(diǎn)，RNA和RNA酶從DNAL鏈上脫落， 轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)雙鏈狀態(tài)。§ 編碼鏈（coding strand）：不作模板轉(zhuǎn)錄的鏈，又稱有義鏈（sense strand）§ 反義鏈(antisense strand)：

3、作為模板轉(zhuǎn)錄的鏈，又稱模板鏈(template strand)。3、RNA功能： 單鏈形式存在于生物體內(nèi)，貯藏及轉(zhuǎn)移遺傳信息 作為核酶在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其代謝功能 少數(shù)RNA病毒，RNA作為其遺傳物質(zhì)4、RNA合成的基本特征 合成RNA的底物磷酸酯鍵僅以DNA一條鏈作為模板RNA合成的方向是從53不需要引物，可以單獨(dú)起始鏈的合成在合成時(shí)，第一個(gè)rNTP是以三磷酸形式存在的A-T，G-C，C-G，U-A合成的RNA序列和模板是互補(bǔ)的。5、RNA合成與DNA復(fù)制的區(qū)別：模板；引物；雙鏈狀態(tài)；底物；聚合酶§ 轉(zhuǎn)錄單位(transcription unit)：由啟動(dòng)子到終止子的序列 §

4、上游(upstream)：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（+1）前面的序列。（-10、-20） § 下游(downstream) ：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)后面的序列。（+10、+20等）§ 單順?lè)醋樱?monocistron ）：一個(gè)mRNA僅編碼一種蛋白質(zhì) 。真核生物§ 多順?lè)醋樱?polycistron ）：幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因，利用共同的啟動(dòng)子及共同的終止信號(hào)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄作用生成mRNA分子。二、RNA聚合酶1、原核生物的RNA聚合酶大腸桿菌RNA聚合酶- 2 大腸桿菌RNA聚合酶由多亞基組成。2稱為全酶(holoenzyme)，分子量約為 480kDa。亞基與全酶結(jié)合疏松，應(yīng)用磷酸纖維素柱很容易使之

5、與全酶分離。解離后的部分稱為核心酶(Core enzyme)( 2)。全酶可以起始RNA的合成，之后亞基從全酶解離下來(lái)。全酶的組裝過(guò)程可能如下: 2。各亞基的功能已有了一定的了解。2核心酶具有催化活性。因子使全酶識(shí)別啟動(dòng)子并與之結(jié)合，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的起始。亞基參與全酶的組裝及全酶識(shí)別啟動(dòng)子，還參與全酶與一些調(diào)控因子的作用。亞基具有與底物NTP及新生RNA鏈結(jié)合的能力。亞基參與模板結(jié)合，和亞基提供了RNA聚合酶的活性中心。亞基的功能：核心酶在DNA上滑動(dòng)，亞基能增加酶與DNA啟動(dòng)子的結(jié)合常數(shù)，增加停留時(shí)間，使聚合酶迅速找到啟動(dòng)子并與之結(jié)合，亞基本身無(wú)催化活性。不同的因子識(shí)別不同的啟動(dòng)子，從而表達(dá)不同的

6、基因。2、真核生物的RNA聚合酶在真核生物細(xì)胞中，共有三類RNA聚合酶，即RNA聚合酶、和，分別負(fù)責(zé)三類基因的轉(zhuǎn)錄。分類的依據(jù)采用了根據(jù)對(duì)鵝膏蕈堿(- amanitine)的敏感性不同來(lái)分類的方法。它們?cè)诩?xì)胞核中的定位不同，對(duì)鵝膏蕈堿的敏感性有差異。動(dòng)物、植物和昆蟲(chóng)的RNA聚合酶最不敏感，RNA聚合酶最敏感。不同來(lái)源的RNA聚合酶有些差異，動(dòng)物細(xì)胞的RNA聚合酶的敏感性介于I和II之間，受高濃度的鵝膏蕈堿的抑制；酵母和昆蟲(chóng)的RNA聚合酶不受抑制。RNA聚合酶的抑制劑在分類上有一定的意義。在細(xì)胞核中，RNA聚合酶I位于核仁，活性所占比例最大，負(fù)責(zé)rRNA(5.8S、18S和 28S)的轉(zhuǎn)錄。由于

7、rRNA占總RNA的比例最大，所以RNA聚合酶I負(fù)責(zé)了大部分細(xì)胞 RNA的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶II位于核質(zhì)，活性所占比例次于RNA聚合酶I，主要負(fù)責(zé)核不均一RNA (heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)、 (核內(nèi)小分子RNA，small nuclear RNA)和mRMA前體的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶也位于核質(zhì)，活性所占比例最小，負(fù)責(zé)tRNA、5SrRNA、Alu序列和其他小RNA( snRNA)的轉(zhuǎn)錄。真核生物的RNA聚合酶的分子量均很大，為5OOkDa或更大。由8至14個(gè)亞基組成。經(jīng)純化的RNA聚合酶具有以DNA為模板合成RNA的能力，但不能正確的選擇啟動(dòng)子。目前尚不能

8、完成RNA聚合酶的體外重建，所以無(wú)法確定哪些亞基是活性所必需的，哪些是活性所非必需，是不是所有的亞基都是活性所必需的。目前了解最為詳細(xì)的是釀酒酵母，所有的亞基均n3找到了編碼的基因，其中1011個(gè)亞基是活性所必需的。RNA聚合酶亞基§ 均含有E.coli核心酶2相同源的亞基§ 最大亞基與 E.coli RNA聚合酶中的亞基相似§ 第二亞基與E.coli 的含有活性位點(diǎn)的亞基相似§ 至少還有五種小亞基普遍存在于三種酶中，47種存在于特定的一種酶中三、啟動(dòng)子§ 啟動(dòng)子(promoter是指DNA分子上被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的區(qū)域

9、。它還包括一些調(diào)節(jié)蛋白因子的結(jié)合位點(diǎn)。 1、原核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能 不同的啟動(dòng)子都存在保守的共同序列，包括RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)（1）轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)在多數(shù)情況(>90%)下為嘌呤，常見(jiàn)的序列為CAT, A為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) CAT的保守程度還不夠高，因而不能做為固定的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)序列 （2）-10序列（Pribnow框）§ Pribnow和Schaller于1975年發(fā)現(xiàn)§ 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游大約-10處§ 保守序列為TATAAT(T80、A95、T45、A69、A50、T96)§ 功能為：與RNA聚合酶緊密結(jié)合；形成開(kāi)放啟動(dòng)子復(fù)合體；使RNA

10、聚合酶定向轉(zhuǎn)錄（3）-35序列（Sexfama box）§ 堿基出現(xiàn)頻率如下：T85 T83 G81 A61 C69 A52 ，其中TTG十分保守。§ RNA酶的識(shí)別區(qū)域。§ 功能：原核RNA聚合酶全酶依靠因子的初始識(shí)別位點(diǎn)。§ 對(duì)RNA聚合酶全酶有很高的親和性。§ -35序列的核苷酸結(jié)構(gòu)，在很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度，RNA聚合酶易識(shí)別強(qiáng)的啟動(dòng)子（4）-10區(qū)和-35區(qū)間的距離 § 90%的原核生物啟動(dòng)子為16到19bp§ 堿基的數(shù)目即該距離的長(zhǎng)短卻是至關(guān)重要的 § 適宜的距離可以為RNA聚合酶提供合適的空間結(jié)

11、構(gòu) 原核生物啟動(dòng)子的特點(diǎn) 結(jié)構(gòu)典型，都含有識(shí)別（R）、結(jié)合（B）和起始（I）三個(gè)位點(diǎn)。序列保守位置和距離都比較恒定。直接和RNA聚合酶相結(jié)合。多和操縱子相鄰。都在其控制基因的5端。決定轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和方向。2、 真核生物的啟動(dòng)子 1 RNA聚合酶I的啟動(dòng)子核心啟動(dòng)子： -45至+20的區(qū)域內(nèi)(core promoter)上游調(diào)控元件：-180至-107,可提高核心啟(upstream control element,UCE) 動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始效率 2 RNA聚合酶III的啟動(dòng)子§ 內(nèi)部啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游 5S rRNA和tRNA § 上游啟動(dòng)子：snRNA OCT

12、(八聚核苷酸元件)、PSE(近端序列元件)、TATA(TATA框)3 RNA聚合酶II的啟動(dòng)子§ 上游元件§ 應(yīng)答元件§ “通用”啟動(dòng)子：可在任何細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，沒(méi)有組織特異性，不依賴于在組織特異性調(diào)控下使用的序列，有功能但效率低。（1）上游元件（upstream element）§ TATA box (TATAAAA ) 位于-2530bp 有些突變不影響轉(zhuǎn)錄的起始，但改變轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)§ CAAT box (GGCCAATCT)，位于-70-80bp 突變對(duì)轉(zhuǎn)錄起始頻率影響很大 § GC box(GGGCGG)，位于 -80-110b

13、p 影響不大§ octamer(an 8bp element) 應(yīng)答元件：可被一些起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別，使基因?qū)@些調(diào)節(jié)因子作出反應(yīng)的序列（3）增強(qiáng)子（Enhancer） 增強(qiáng)子是與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的位點(diǎn)，具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄起始的作用。相對(duì)于啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)，增強(qiáng)子的位置不是固定的，變化很大（-珠蛋白）功能：增強(qiáng)子很可能通過(guò)影響染色質(zhì)DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或改變超螺旋的密度而改變模板的整體結(jié)構(gòu)，從而使得RNA聚合酶更容易與模板DNA相結(jié)合，起始基因轉(zhuǎn)錄。四、轉(zhuǎn)錄機(jī)制（過(guò)程）§ 1、原核生物轉(zhuǎn)錄（1） 轉(zhuǎn)錄的起始 RNA聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子并與之結(jié)合 從而啟動(dòng)RNA合成的過(guò)程 核心酶在因子的參與

14、下與DNA分子接觸，形成非專一復(fù)合物 起始識(shí)別：全酶與啟動(dòng)子結(jié)合形成封閉的啟動(dòng)子復(fù)合物，這時(shí)酶與DNA的外部結(jié)合，識(shí)別部位大約在啟動(dòng)子的-35區(qū)處活化：形成開(kāi)放的啟動(dòng)子復(fù)合物，酶在-10區(qū)緊密與啟動(dòng)子結(jié)合，解開(kāi)雙鏈后識(shí)別有意義鏈 形成三元起始復(fù)合物（啟動(dòng)子、全酶、核苷三磷酸）（2） 轉(zhuǎn)錄的延伸§ 轉(zhuǎn)錄起始后，亞基釋放，離開(kāi)核心酶，使核心酶的亞基構(gòu)象變化，與DNA模板親和力下降，在DNA上移動(dòng)速度加快，使RNA鏈不斷延長(zhǎng)。40核苷酸/秒§ 旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)和拓?fù)洚悩?gòu)酶I消除負(fù)超螺旋和正超螺旋 § 亞基便從全酶中解離出來(lái)，然后nusA亞基結(jié)合到核心酶上，由nus

15、A亞基識(shí)別序列（3） 轉(zhuǎn)錄終止§ RNA聚合酶到達(dá)轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)時(shí)，在終止輔助因子的幫助下，聚合反應(yīng)停止，RNA鏈和聚合酶脫離DNA模板鏈§ nusA又被亞基所取代 終止點(diǎn)之前都有一個(gè)回文結(jié)構(gòu)，它轉(zhuǎn)錄出來(lái)的RNA可以形成一個(gè)頸環(huán)式的發(fā)莢結(jié)構(gòu)。在大腸桿菌中，有兩種類型的終止子，一類為內(nèi)在終止子(intrinsic terminator)，在體外實(shí)驗(yàn)中，只有核心酶和終止子就足以使轉(zhuǎn)錄終止，不依賴其他輔助因子；另一類終止子必須在因子(-factor)的存在下核心酶才能終止轉(zhuǎn)錄，因此稱為依賴 因子的終止子(-dependent terminator)。第一類終止子又稱為不依賴因子的終止

16、子。二種類型的終止子在結(jié)構(gòu)上有一定的差異。a:不依賴因子的終止子： 不依賴因子的終止子結(jié)構(gòu)特征：一是形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin)，二是發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端緊跟著6個(gè)連續(xù)的U串。不同終止子的發(fā)夾結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度有差異，在72Obp之間，由一反向重復(fù)序列構(gòu)成莖，中間的間隔形成環(huán)。在莖的底部有一富含GC對(duì)的區(qū)域。發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的突變可阻止轉(zhuǎn)錄的終止，說(shuō)明發(fā)夾結(jié)構(gòu)的重要作用。經(jīng)研究確定，新生RNA鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可使RNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)暫停，暫停的時(shí)間不同終止子有所差異，但典型的終止子暫停時(shí)間為60秒左右。轉(zhuǎn)錄的終止并不只依賴于發(fā)夾結(jié)構(gòu)，新生的RNA中可有多處發(fā)夾結(jié)構(gòu)。RNA聚合酶的暫停只是為轉(zhuǎn)錄的終止提供了機(jī)會(huì)

17、，如果沒(méi)有終止子序列，聚合酶可以繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，而不發(fā)生轉(zhuǎn)錄的終止。6個(gè)連續(xù)的U串可能為RNA聚合酶與模板的解離提供信號(hào)。RNA-DNA間的rU·dA結(jié)合力較弱，有利于RNA和DNA的解離。如果將U串缺失或縮短，盡管RNA聚合酶可以發(fā)生暫停，但不能使轉(zhuǎn)錄終止。DNA上與U串對(duì)應(yīng)的為富含AT對(duì)的區(qū)域，這說(shuō)明AT富含區(qū)在轉(zhuǎn)錄的終止和起始中均起重要的作用。b:依賴的終止子依賴的終止子，必需在因子存在時(shí)，才發(fā)生終止作用。終止點(diǎn)前無(wú)寡聚U序列，回文對(duì)稱區(qū)不富含GC因子§ 分子量為46kDa，活性形式為六聚體，270kDa § 有依賴RNA的 ATPase活性 § 與新生

18、RNA在終止子上游的某一處與RNA結(jié)合 § 因子具有使RNA-DNA雜交體解離的作用 （1） 真核生物轉(zhuǎn)錄的起始過(guò)程（a）RNA聚合酶I的轉(zhuǎn)錄起始： 需要兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子§ UBF1:一條多肽鏈組成 具有序列特異性:識(shí)別核心啟動(dòng)子和UCE中富含GC對(duì)的區(qū)域 § SL1 具有種屬特異性（b）RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄起始鋅指 一組保守的氨基酸結(jié)合了一個(gè)鋅離子，在蛋白質(zhì)中形成了獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域§ 功能 結(jié)合DNA；結(jié)合蛋白質(zhì)（同二聚體，異二聚體）;激活轉(zhuǎn)錄（c）RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄因子§ 通用啟動(dòng)子 基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子 （2） 真核生物轉(zhuǎn)錄的延伸和終止§

19、; 靠多種輔助因子的共同作用下來(lái)延伸新鏈 § 終止機(jī)理不清楚： RNA聚合酶I ：輔助因子識(shí)別一18bp的終止子序列 RNA聚合酶II和 與原核相似，RAN聚合酶識(shí)別 終止子五、RNA轉(zhuǎn)錄后的加工 RNA聚合酶合成的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，要經(jīng)過(guò)剪切、修飾、拼接等過(guò)程，才能轉(zhuǎn)變成成熟的RNA分子，此過(guò)程稱RNA轉(zhuǎn)錄后的加工1、原核生物轉(zhuǎn)錄后的加工（1） 原核tRNA、rRNA（穩(wěn)定的RNA）a. tRNA、rRNA 5 '是單磷酸b. 成熟 tRNA、rRNA分子都比原初轉(zhuǎn)錄物小c. 所有的tRNA分子，都有原初轉(zhuǎn)錄物所沒(méi)有的稀有堿基 （A、G、C、U以外的堿基）（2） 原核mRNA&

20、#167; 半衰期短§ 以多順?lè)醋拥男问酱嬖?#167; 5端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，3端沒(méi)有或只有短的poly(A)結(jié)構(gòu)（3） 原核生物rRNA、tRNA的加工 rRNA基因與某些tRNA基因組成混合并與編碼蛋白質(zhì)的基因組成操縱子，在形成多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄物后，斷裂成為rRNA和tRNA的前體，然后進(jìn)一步加工成熟。（4） 原核mRNA前體的加工 單順?lè)醋訕?gòu)成mRNA，不需加工，直接進(jìn)行翻譯。 多順?lè)醋訕?gòu)成mRNA，核酸內(nèi)切酶切成較小的mRNA， 再進(jìn)行翻譯。 例：核糖體大亞基蛋白L10、L7、L12與RNA聚合酶、亞基的基因組成混合操縱子 2、真核生物轉(zhuǎn)錄后的加工（1）真核生物的mRNA§

21、 a: 5端存在帽子結(jié)構(gòu)：甲基化的鳥(niǎo)嘌呤帽子結(jié)構(gòu)的功能 ：使mRNA免受核酸酶的降解，增加mRNA的穩(wěn)定性有助于mRNA越過(guò)核膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)使mRNA能與核糖體小亞基結(jié)合并開(kāi)始合成蛋白質(zhì)被蛋白質(zhì)起始因子識(shí)別與某些RNA病毒的正鏈RNA的合成有關(guān)§ b: 3端存在 poly(A)結(jié)構(gòu) polyA的功能:提高mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。協(xié)助mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。作為核糖體的識(shí)別信號(hào)，使mRNA分子有效翻譯。對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控有重要作用。（2）tRNA、rRNA的加工A:   tRNA前體的拼接酵母tRNA約有400個(gè)基因，有內(nèi)含子的基因約占1/10，內(nèi)含子長(zhǎng)度1

22、4-46bp，沒(méi)有保守性。切除內(nèi)含子的酶識(shí)別的是tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而不是什么保守序列。拼接過(guò)程：第一步切除內(nèi)含子，第二步RNA連接酶將兩個(gè)tRNA半分子連接。 B: 四膜蟲(chóng)rRNA前體的自我拼接 四膜蟲(chóng)35S rRNA前體，經(jīng)加工可以生成5.8S 、17S和26SrRNA。 某些品系的四膜蟲(chóng)在其26SrRNA基因中有一個(gè)內(nèi)含子，35S rRNA前體需要拼接除去內(nèi)含子。 （3）真核生物mRNA前體的加工§ mRNA原初轉(zhuǎn)錄物是分子量很大的前體，在核內(nèi)加工過(guò)程中形成分子大小不等的中間產(chǎn)物，它們被稱為核內(nèi)不均一RNA（hnRNA）。其中，約有25%可轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA（1）&

23、#160; 5'末端加帽 RNA三磷酸酶，mRNA鳥(niǎo)苷酰轉(zhuǎn)移酶，mRNA（鳥(niǎo)嘌呤-7）甲基轉(zhuǎn)移酶，mRNA（核苷-2 ' ）甲基轉(zhuǎn)移酶。由于甲基化的程度不同，有三種類型的帽子：CAP O型，CAP I型，CAP II型。 5 '帽子也出現(xiàn)于hnRNA，說(shuō)明加帽過(guò)程可能在轉(zhuǎn)錄的早期階段或轉(zhuǎn)錄終止前就已完成。（2）3端加poly（A） 內(nèi)切酶RNAase切斷，多聚A聚合酶催化，加上polyA，ATP為供體。 加尾信號(hào)：AAUAAA（轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)上游15-30bp） 核內(nèi)hnRNA的3 '端也有多聚腺苷酸，表明加尾過(guò)程早在核內(nèi)已經(jīng)完成。hnRNA中的poly（A）平均150-200nt。（3）內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾RNA中的內(nèi)含子內(nèi)含子：外顯子：斷裂基因：一個(gè)基因由多個(gè)內(nèi)含子和外顯子間隔而成。a:生物體內(nèi)各種內(nèi)含子內(nèi)含子類型細(xì)胞內(nèi)定位GU