七種觀察方式

1、奧林巴斯光學(xué)北京辦事處奧林巴斯光學(xué)北京辦事處齊冬齊冬1.明場觀察明場觀察2.暗場觀察暗場觀察(暗視野暗視野)3.相差觀察相差觀察(相襯觀察相襯觀察)4.偏光觀察偏光觀察5. DIC觀察觀察(微分干涉微分干涉)6. RC觀察觀察(浮雕相襯浮雕相襯)7.熒光觀察熒光觀察常規(guī)觀察方式常規(guī)觀察方式應(yīng)用領(lǐng)域：應(yīng)用領(lǐng)域：常規(guī)鏡檢、病理、染色標(biāo)本優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：視野亮度高、均勻，應(yīng)用范圍廣，操作簡單，價(jià)格低，物鏡適用于熒光觀察缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：透明標(biāo)本對比度低，標(biāo)本沒有立體感刻度指示刻度指示調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)指示N.A聚= =(0 0.6-06-0.8 8)N.A物100%70%30%HRLCHCLRMRMC1 原理

2、原理丁道爾(Tyndall)現(xiàn)象，微粒對斜射光反射或衍射，增大了人眼可見性。2 特點(diǎn)特點(diǎn)觀察到極其微小物體，分辨率可達(dá)0.02 0.004 um (明場0.24um)”超顯微“。3 缺點(diǎn)缺點(diǎn)只能觀察到物體存在、運(yùn)動(dòng)和外部形態(tài)不方便調(diào)節(jié)標(biāo)本要求高（灰塵、蓋片、載片）1 原理原理利用被檢物體的光程（折射率 x 厚度）差進(jìn)行鏡檢，即利用干涉現(xiàn)象，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹罟曹椕妫何展饩€，直射光通過共軛面：吸收光線，直射光通過補(bǔ)償面：相位推遲，衍射光通過補(bǔ)償面：相位推遲，衍射光通過物鏡物鏡相板相板 聚光鏡環(huán)狀光闌聚光鏡環(huán)狀光闌2 特點(diǎn)特點(diǎn)鑒定活體細(xì)胞最實(shí)用、最經(jīng)濟(jì)的方法3 缺點(diǎn)缺點(diǎn)需要光強(qiáng)高切

3、片不能太厚(210um)蓋片、載片需符合標(biāo)準(zhǔn)最好配用單色濾光鏡操作較麻煩熒光效果不如明場物鏡4 應(yīng)用：應(yīng)用：無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，檢查,鑒定活體細(xì)胞(培養(yǎng)細(xì)胞,分離細(xì)胞)5 調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)：苛勒照明調(diào)節(jié)將相差物鏡及附件轉(zhuǎn)入光路（物鏡聚光鏡相襯環(huán)型號匹配）對樣品聚焦取下目鏡，裝上CT望遠(yuǎn)鏡，調(diào)節(jié)CT焦距看到清晰的相差環(huán)調(diào)節(jié)聚光鏡上定位螺絲，使環(huán)狀光闌象與相板共軛面重合1 原理原理依據(jù)波動(dòng)光學(xué)原理觀察和精密測定標(biāo)本細(xì)節(jié),或透明物體改變光束的物理參數(shù),以此判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種顯微鏡自然光（多自然光（多振動(dòng)面）振動(dòng)面）偏振器偏振器1偏振器偏振器2偏振光（單偏振光（單一振動(dòng)面）一振動(dòng)面）各向同性：單折射

4、體，光性質(zhì)不因照射方向而改變，普通氣體、液體、非結(jié)晶固體等各向異性：雙折射體，光速度、折射率、吸收和振動(dòng)面、振幅隨照射方向不同，晶體、纖維等應(yīng)用：應(yīng)用：礦物質(zhì)、化學(xué)物品鑒別鑒別纖維、染色體、淀粉粒、細(xì)胞中晶體植物病理檢驗(yàn)鑒別骨骼、牙齒、膽固醇、神經(jīng)纖維、腫瘤細(xì)胞、橫紋肌和毛發(fā)等1 原理原理通過特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強(qiáng)度相等的光束，光束載極近的兩點(diǎn)（小于顯微鏡的分辨率）上通過被檢物體，從而在相位上略有差別，使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺。2 特點(diǎn)特點(diǎn)可以使被檢物體產(chǎn)生三維立體感覺觀察效果更直觀無須特殊物鏡，與熒光觀察配合更好可以調(diào)節(jié)背景和物體的顏色變化而達(dá)到理想的效果。3 缺點(diǎn)缺點(diǎn)需要光強(qiáng)高

5、，雙折射物質(zhì)不能達(dá)到DIC鏡檢效果，不能應(yīng)用于塑料容器培養(yǎng)物的觀察，鏡檢靈敏度有方向性，調(diào)節(jié)較復(fù)雜4 應(yīng)用：應(yīng)用：無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，無無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，無色熒光標(biāo)本，染色標(biāo)本，顯微操作色熒光標(biāo)本，染色標(biāo)本，顯微操作等等1 原理原理斜射光照射到標(biāo)本產(chǎn)生折射、衍射，光線通過物鏡光密度梯度調(diào)節(jié)器產(chǎn)生不同陰影，從而使透明標(biāo)本表面產(chǎn)生明暗差異，增加觀察對比度。2. 歷史歷史1975年，Robert Hoffman 博士發(fā)明2002年，專利到期，各顯微鏡廠家紛紛推出采用以自己名義命名的RC技術(shù)產(chǎn)品3. 特點(diǎn)特點(diǎn)提高未染色標(biāo)本的可見性和對比度；圖象顯示陰影或近似三維結(jié)構(gòu)而不會(huì)產(chǎn)生光暈；可

6、檢測雙折射物質(zhì)(巖石切片、水晶、骨頭) ；可檢測玻璃,塑料等培養(yǎng)皿中的細(xì)胞,器官和組織；聚光鏡的工作距離可以設(shè)計(jì)的更長； RC物鏡也可用于明場,暗場和熒光觀察4. 缺點(diǎn)缺點(diǎn)觀察效果與標(biāo)本方向密切相關(guān)操作較復(fù)雜必須有多元件,結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高數(shù)值孔徑RC物鏡觀察熒光效果不如明場物鏡5. 應(yīng)用應(yīng)用所有類型的細(xì)胞，組織（無論活體，染色，未染色），晶體表面細(xì)節(jié)，透明聚合物，玻璃和其它類似材料，尤其適用于顯微操作l 物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槲镔|(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光，是非高能狀態(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光，是非溫度輻射光溫度輻射光冷光。即：物

7、質(zhì)吸收短波光，發(fā)冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。射出的長波光。l顯微鏡熒光利用光源激發(fā)顯微鏡熒光利用光源激發(fā)光化熒光光化熒光寬譜線發(fā)射光寬譜線發(fā)射光（汞燈）（汞燈）濾掉其他光，透過濾掉其他光，透過激發(fā)光激發(fā)光激發(fā)濾激發(fā)濾色片色片吸收濾吸收濾色片色片濾掉激發(fā)光，透過濾掉激發(fā)光，透過熒光熒光標(biāo)本受激發(fā)產(chǎn)生標(biāo)本受激發(fā)產(chǎn)生熒光向四周發(fā)散熒光向四周發(fā)散激發(fā)光受反射、折射激發(fā)光受反射、折射或衍射向四周發(fā)散或衍射向四周發(fā)散l吸收光，必需有激發(fā)光源吸收光，必需有激發(fā)光源l熒光波長激發(fā)波長（損失熱能）熒光波長激發(fā)波長（損失熱能）l熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度l有不同程度的衰減有

8、不同程度的衰減l熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率度、熒光效率優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：l檢出能力高（放大作用）檢出能力高（放大作用）l對細(xì)胞的刺激?。梢曰铙w染色）對細(xì)胞的刺激小（可以活體染色）l能進(jìn)行多重染色能進(jìn)行多重染色用途：用途：l物體構(gòu)造的觀察物體構(gòu)造的觀察熒光素?zé)晒馑豯熒光的有無、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別熒光的有無、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別抗體抗體熒光等熒光等l發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析 透射式透射式l吸收濾色鏡吸收濾色鏡l暗場聚光鏡暗場聚光鏡l激發(fā)濾色鏡激發(fā)濾色鏡l汞燈光源汞燈光源 落射式落射式l吸收濾色鏡吸收濾色

9、鏡l分光鏡分光鏡l激發(fā)濾色鏡激發(fā)濾色鏡l汞燈光源汞燈光源 汞燈光源汞燈光源: :提供激發(fā)光提供激發(fā)光(U(U、V V、B B、G) G) 氙燈光源：氙燈光源： 高峰值更寬，更穩(wěn)定高峰值更寬，更穩(wěn)定 激發(fā)激發(fā)濾色鏡濾色鏡: : 激發(fā)波長選擇激發(fā)波長選擇 激發(fā)透鏡組激發(fā)透鏡組（激發(fā)塊）（激發(fā)塊）: : T%nmBAND PASS入射光入射光發(fā)射光發(fā)射光激發(fā)激發(fā) 濾色鏡濾色鏡分光分光 濾色鏡濾色鏡吸收吸收 濾色鏡濾色鏡 吸收濾色鏡吸收濾色鏡: :熒光透過熒光透過, ,阻擋雜光阻擋雜光 分色鏡分色鏡: :反射激發(fā)光反射激發(fā)光, ,熒光透過熒光透過A 透過透過AA 反射反射BB 透過透過B 阻擋阻擋nm

10、nmT%T%A 吸收濾色鏡吸收濾色鏡: :熒光透過熒光透過, ,阻擋雜光阻擋雜光 分色鏡分色鏡: :反射激發(fā)光反射激發(fā)光, ,熒光透過熒光透過A 透過透過AA 反射反射BB ，C 透過透過nmnmT%T%AC熒光素?zé)晒馑丶ぐl(fā)波長激發(fā)波長 發(fā)射波長發(fā)射波長DAPI372372456456AMCA350350450450Hoechst 33258365365465465FITC490490520520Acridine Orange490490590590Acridine Yellow470470550550CY3552552565565TRITC541541572572Propidium Iodi

11、de530530615615SWB: BP420-480SWB: BP420-480WB: BP450-480WB: BP450-480WIB: BP460-490WIB: BP460-490NB: BP470-490NB: BP470-490 WUWU WIBWIBDUALDUAL BANDBANDWIBAWIBAWIGWIGWIBWIB光欄全開啟光欄全開啟光欄適當(dāng)關(guān)小光欄適當(dāng)關(guān)小減少雜散光干擾減少雜散光干擾 防衰減的方法防衰減的方法l使用抗衰減劑使用抗衰減劑l選擇衰減小的熒光素選擇衰減小的熒光素l降低激發(fā)光強(qiáng)度降低激發(fā)光強(qiáng)度l降低標(biāo)本中氧的濃度降低標(biāo)本中氧的濃度有衰減的標(biāo)本有衰減的標(biāo)本燈室，上下、左右旋鈕，聚光鏡旋鈕燈室，上下、左右旋鈕，聚光鏡旋鈕1.明場觀察明場觀察常規(guī)染色片（常規(guī)染色片（HE染色等）染色等）2.暗場觀察暗場觀察微粒外觀（細(xì)菌記數(shù)等）微粒外觀（細(xì)菌記數(shù)等）3.相差觀