雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

1、僅供個(gè)人參考實(shí)驗(yàn)二十 蛋白質(zhì)含量測(cè)定雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理在堿性溶液中，雙縮脲(H2N-CO-NH-CO-NH2) 與二價(jià)銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含二個(gè)或二個(gè)以上酰胺基(CO-NH2)，或與此相似的基團(tuán) 如 CH2-NH2 ，CS-NH2，C(NH)NH2 的任何化合物，無(wú)論這類基團(tuán)直接相連還是通過(guò)一個(gè)碳或氮原子間接相連， 均可發(fā)生上述反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵 ( CO-NH )，可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且呈色強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比， 可用比色法測(cè)定蛋白含量。測(cè)

2、定范圍為 110mg 蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、 Tris 緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近， 以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。 因此雙縮脲法常用于快速， 但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。三、實(shí)驗(yàn)試劑和器材試劑 1雙縮脲試劑： 取 CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸鉀鈉 (c.P.)6.0g以少量蒸餾水溶解，再加 2.5molL NaOH 溶液 300ml， KI 1.0g，然后加水至 1000ml。棕色瓶中避光保存。長(zhǎng)期放置后若有暗紅色沉淀出現(xiàn)，即不能使用。2標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液： 用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（ B

3、SA ）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成 10g/L 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用 BSA 濃度 1g/L 的 A280 為 0.66 來(lái)校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量， 計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl 配制，酪蛋白用 0.05mol/L NaOH 配制。器材 1試管： 15×150mm 試管 7 只；21ml，5ml 移液管；不得用于商業(yè)用途僅供個(gè)人參考3坐標(biāo)紙；4721 分光光度計(jì)。四、實(shí)驗(yàn)操作取試管 7 支，編號(hào)，按下表操作：試劑空白管12345測(cè)定管管號(hào)蛋白標(biāo)準(zhǔn)-0.10.20.30.40

4、.5液（10g/L）生理鹽水0.50.40.30.20.1-0.4待測(cè)樣品-0.1雙縮脲試3.03.03.03.03.03.03.0劑相當(dāng)?shù)鞍?1020304050-質(zhì)（ g/L）混勻， 37水浴 20 分鐘，冷卻至室溫，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)540nm 處，用空白管調(diào)零，讀取各管吸光度值。1 5為標(biāo)準(zhǔn)曲線管，測(cè)得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以測(cè)定管的吸光度， 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得蛋白質(zhì)濃度。注意事項(xiàng) 1雙縮脲試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2+形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子，以防止CuSO4· 5H20 不穩(wěn)定形成 Cu(OH)2 沉淀。酒石酸鉀鈉與 CuSO4·

5、 5H20 之比不低于 3 1，加入 KI 作為抗氧化試劑。2雙縮脲試劑要封閉貯存，防止吸收空氣中的二氧化碳。3本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點(diǎn)是靈敏度較低。4黃疸血清、嚴(yán)重溶血對(duì)本法有明顯干擾。思考題 1雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理是什么?其它還有什么方法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量?2請(qǐng)用雙縮脲法，設(shè)計(jì)一個(gè)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的定量方法(除標(biāo)準(zhǔn)曲線法外 )。不得用于商業(yè)用途僅供個(gè)人參考僅供個(gè)人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途。For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f ü r den pers?nlichen fü r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l 'é tude et la recherche uni