JNK在驚厥持續(xù)狀態(tài)幼年大鼠海馬中的表達(dá)及依達(dá)拉奉對(duì)其的影響

1、JNK在驚厥持續(xù)狀態(tài)幼年大鼠海馬中的表達(dá)及依達(dá)拉奉對(duì)其的影響                     作者：陸海燕，鄧小龍，李光乾，李偉【摘要】  目的 ：研究(JNK)在驚厥持續(xù)狀態(tài)(SC)幼年大鼠海馬中的表達(dá)及依達(dá)拉奉對(duì)其的影響。方法：雄性SD幼年大鼠120只分為正常對(duì)照組(NC組)、驚厥持續(xù)狀態(tài)組(SC組)、依達(dá)拉奉組(EDA組)三大組;各大組均隨機(jī)分為5組，分別于驚厥后4、12、

2、24、48和72 h處死。采用氯化鋰-匹魯卡品法制作驚厥持續(xù)狀態(tài)模型。EDA組在大鼠造模前三天予EDA腹腔注射，每天注射一次，連續(xù)3 d。TUNEL法檢測(cè)觀察大鼠海馬細(xì)胞凋亡情況;免疫組化法檢測(cè)海馬p-JNK蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)變化;RT-PCR技術(shù)檢測(cè)海馬JNK1 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果：SC組在驚厥12 h后的各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)均顯著高于NC組(P<0.01)，而ED組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)均較SC組顯著下降(P <0.01或P <0.05)。幼年大鼠海馬CA1區(qū)p-JNK蛋白在SC組表達(dá)顯著增強(qiáng)，與NC組比較差異有顯著性(P <0.01)，在ED

3、A組表達(dá)較SC組明顯下降(P <0.01)。SC組海馬JNK1 mRNA表達(dá)明顯高于NC組(P <0.01)，而在EDA組JNK1 mRNA的表達(dá)較SC組顯著降低(P <0.01)。結(jié)論：SC可誘導(dǎo)JNK的表達(dá)，促進(jìn)SC后海馬神經(jīng)元凋亡;EDA預(yù)處理可以影響JNK的表達(dá)，減輕驚厥后海馬神經(jīng)元凋亡程度。 【關(guān)鍵詞】  驚厥;腦損傷;幼年大鼠;JNK;依達(dá)拉奉A(yù)bstract: Objective: To observe the change of JNK in the hippocampus of status convulsive rat and the regul

4、ation effect of EDA on it. Methods: One hundred and twenty male Juvenile Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into normal control group (NC)， status convulsivus group (SC)， and edaravone group (EDA);and every group were randomly divided into five groups， which would be executed at 4 h，12 h，2

5、4 h，48 h and 72 h after convulsion discontinued. Status convulsivus (SC)was induced by injecting Lithium Chloride and Pilocarpine. Group EDA were injected EDA before convulsion，and repeatedly every day for 3 days. The expression of apoptosis cells were observed with TdT-mediated dUTP nick end labeli

6、ng (TUNEL)，the changes of p-JNK protein in the hippocampus CA1 domains were detected with immunohistochemistry(IHC)，the expression of JNK1 mRNA were detected with RT-PCR. Results: The TUNEL positive cells in hippocampus CA1 of SC group were more than that of NC group at 12 h after the SC(P <0.01)

7、. After the intervention of edaravone，TUNEL positive cells showed a significant drop (P <0.01 or P <0.05). The expression of p-JNK protein in the hippocampus CA1 domains increased markedly in SC group. The difference was statisticaly significance compared with NC group (P <0.01)， and EDA gr

8、oup was much lower than SC group (P <0.01). The expression of JNK1 mRNA in the hippocampus in SC Group was much higher than NC Group (P <0.01)，and EDA group was significantly lower than SC group(P <0.01). Conclusion: SC maybe increase the expression of JNK， JNK may be mediated to cell apopt

9、osis. EDA can effect the expression of JNK， and lessen the pothology of hippocampus.Key words: convulsion;brain injury;juvenile rat;JNK;edaravone驚厥是小兒時(shí)期較常見的急癥。當(dāng)驚厥反復(fù)發(fā)作而未能很好控制時(shí)，可導(dǎo)致進(jìn)行性腦損傷，并可造成認(rèn)知損害1。多種因素導(dǎo)致神經(jīng)元壞死和細(xì)胞凋亡是驚厥性腦損傷的基本原因。JNK(C-Jun N端激酶)是凋亡途徑中重要的信號(hào)分子，已有部分學(xué)者對(duì)其參與神經(jīng)元凋亡的情況做了研究。然而在驚厥持續(xù)狀態(tài)(status convuls

10、ive，SC)后的表達(dá)情況目前尚未見相關(guān)報(bào)道。依達(dá)拉奉(edaravone，EDA)對(duì)低氧缺血性腦病的神經(jīng)元保護(hù)作用已得到證實(shí)2，但其對(duì)于SC后JNK的表達(dá)及神經(jīng)元凋亡的影響情況，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立氯化鋰-匹魯卡品SC大鼠模型，觀察幼年大鼠海馬p-JNK蛋白及JNK1 mRNA表達(dá)的變化，及依達(dá)拉奉對(duì)SC后海馬JNK表達(dá)及神經(jīng)元凋亡情況的影響，初步探討JNK與驚厥性腦損傷的關(guān)系及依達(dá)拉奉在SC幼鼠中可能的神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制。1 材料和方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 清潔級(jí)健康幼年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(購自中國科學(xué)院上海分院試驗(yàn)動(dòng)物中心)120只，體重5070 g。

11、氯化鋰、匹羅卡品購自美國Fluka公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國羅氏公司。鼠抗p-JNK單克隆抗體購自美國Stancru公司。M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，依達(dá)拉奉由南京先聲東元制藥有限公司資助。1.2 實(shí)驗(yàn)分組和SC動(dòng)物模型的建立 隨機(jī)將SD大鼠分為正常對(duì)照組(NC組)、驚厥持續(xù)狀態(tài)組(SC組)、依達(dá)拉奉組(EDA組)三大組，每組40只大鼠;各大組再隨機(jī)分為5小組，分別于驚厥后4、12、24、48和72 h處死。若因模型不成功、死亡造成各亞組樣本量不足8只的，按隨機(jī)原則補(bǔ)足。采用氯化鋰-匹魯卡品法制作SC模型。SC模型制作參照胡越等3方法。驚厥按

12、Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為V級(jí)，驚厥發(fā)作達(dá)到IV-V級(jí)，持續(xù)時(shí)間至少30 min，驚厥解除后狀態(tài)良好的大鼠為合格SC大鼠模型。NC組：不作任何處理。EDA組：造模前3 d予EDA 3 mg/kg腹腔注射，每天注射一次，連續(xù)3 d，其余用藥同SC組。1.3 動(dòng)物標(biāo)本的制備 大鼠分別于驚厥后各時(shí)間點(diǎn)處死。經(jīng)10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉后，斷頭剝離顱骨，完整取出腦組織置于冰盤上，分離右側(cè)海馬腦組織，放入去RNA酶的EP管中，迅速置于液氮中保存。左側(cè)大腦在垂直視交叉處離斷，并冠狀位向后切取約5 mm，放入預(yù)冷的4%多聚甲醛固定12 h，入70%乙醇，送病理科進(jìn)行石蠟包埋;石蠟包埋后制片，

13、切片厚度為5m。1.4 實(shí)驗(yàn)方法1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 多組比較采用單因素方差分析，均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩變量的相關(guān)采用直線相關(guān)分析法分析。2 結(jié)果2.1 各組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果(見圖1) TUNEL結(jié)果顯示，TUNEL陽性細(xì)胞主要在神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒，形成典型的“指環(huán)狀”或“半月狀”的細(xì)胞凋亡特征。SC組海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞于驚厥后4 h已有少量表達(dá)，48 h達(dá)高峰，之后有下降趨勢(shì);其24、48、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于NC組(P <0.01)。EDA組24、48和72 h時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)水平較SC

14、組均明顯降低(P <0.01);但仍高于NC組(P <0.01)(見表2)。2.2 大鼠海馬p-JNK蛋白免疫組化結(jié)果(見圖2) 免疫組化結(jié)果顯示，NC組p-JNK蛋白在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞核少量表達(dá)。SC后4 h海馬CA1區(qū)p-JNK蛋白表達(dá)即開始增加，48 h達(dá)高峰，72 h下降。而EDA組驚厥后各時(shí)間點(diǎn)海馬p-JNK蛋白表達(dá)水平較SC組降低，以24和48 h時(shí)間點(diǎn)為著(P <0.01)(見表3)。2.3 各組大鼠海馬JNK1 mRNA的表達(dá)(見圖3) RT-PCR方法檢測(cè)到NC組大鼠海馬JNK1 mRNA少量表達(dá)。SC組JNK1 mRNA的表達(dá)于驚厥后4 h開始增加，48 h達(dá)高峰，72 h下降。而EDA組驚厥后24和48 h時(shí)間點(diǎn)海馬JNK1 mRNA表達(dá)水平較SC組均明顯降低(P <0.01)(見表4)。2.4 相關(guān)性分析 大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞與CA1區(qū)p-JNK蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(=0.567，n=80，P<0.01)。海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞與JNK1 mRNA表達(dá)正