胰島素的應(yīng)用及發(fā)展前景

1、桂 林 理 工 大 學(xué) 生 物 制 藥 技 術(shù) X課 程 論 文論文名稱： 胰島素的應(yīng)用及發(fā)展前景 系（學(xué)院）： 化學(xué)與生物工程學(xué)院 班級： 學(xué)號： 學(xué)生姓名： 2013年 5 月 21日胰島素的應(yīng)用及發(fā)展前景【摘要】1922年提取得到一種較純的降血糖物質(zhì)，命名為胰島素，1923年開始供應(yīng)臨床使用。1982年，第一個基因工程藥物人胰島素上市。迄今為止，胰島素仍為治療胰島素依賴性糖尿病的特效藥物。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前全世界糖尿病患者已超過一億，而且發(fā)病率呈逐年增長的趨勢。隨著胰島素的發(fā)展，人胰島素類似物應(yīng)運而生，更為糖尿病人帶來了希望。 【關(guān)鍵詞】 蛋白類藥物 胰島素 應(yīng)用 發(fā)展前景目錄【摘要】.

2、2【關(guān)鍵詞】2一、胰島素的基本概念4 1. 胰島素的基本定義.4 2. 胰島素分類4 3、人胰島素(Insulin)6二.重組人胰島素產(chǎn)品生產(chǎn)工藝流程6三、胰島素的發(fā)展歷史及應(yīng)用.7四、胰島素的發(fā)展前景.10【參考文獻】 .13一、胰島素的基本概念 1. 胰島素的基本定義 胰島素的英文縮寫，INS。不同種族動物（人、牛、羊、豬等）的胰島素功能大體相同，成分稍有差異。胰島素由A、B兩個肽鏈組成。人胰島素(Insulin Human)A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共26種51個氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個半胱氨酸中的巰

3、基形成兩個二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。 胰島素是一種蛋白質(zhì)類激素,體內(nèi)胰島素是由胰島細胞分泌的。在人體十二指腸旁邊，有一條長形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布著許許多多的細胞群，叫做胰島。胰島素是由胰島細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。藥理作用:治療糖尿病、消耗性疾病。 生理作用:胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。具有調(diào)節(jié)糖代謝、脂肪代謝、蛋白質(zhì)代謝作用。2.胰島素分類按來源不同分類1、動物胰島素：從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有1個氨基酸不同，牛胰島素

4、中有3個氨基酸不同，因而易產(chǎn)生抗體。2、半合成人胰島素：將豬胰島素第30位丙氨酸，置換成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰島素。 3、生物合成人胰島素：利用生物工程技術(shù)，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同。3、人胰島素(Insulin)：胰島素是多肽激素的一種，具有多種生物功能，在維持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白質(zhì)的合成、調(diào)節(jié)與控制細胞內(nèi)多種代謝途徑等方面都有重要作用。 國外人胰島素的基因工程生產(chǎn)一般采用兩種方式：一是分別在大腸桿菌中合成A鏈和B鏈，再在體外用化學(xué)方法連接兩條肽鏈組成胰島素。 另一種方法是用分泌性載體表達胰島素

5、原。如丹麥Novo用重組酵母分泌產(chǎn)生胰島素原，再用酶法轉(zhuǎn)化為人胰島素。 我的科學(xué)工作者在80年代已開始的胰島素基因表達的研究，但所采用的各種體系有一定問題，故一直未有突破性進展。1993年，北京大學(xué)報道了以部分牛凝乳酶原B基因與人胰島素原基因進行融合，高表達出融合蛋白，經(jīng)加工后可得到具有天然活性的人胰島素原純品。 二.重組人胰島素產(chǎn)品生產(chǎn)工藝流程菌種擴培 對從菌種庫中取出的菌種進行活化及初步擴大培養(yǎng)種子罐培養(yǎng) 在種子罐中對菌種進行進一步的擴大培養(yǎng)，至菌種到對數(shù)生長期時轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)分兩階段進行控制，第一階段主要通過控制溶氧和補加甘油使菌體達到富集的目的，第二階段通過補加甲醇使菌體進行

6、高密度表達目的產(chǎn)物，HPLC檢測目的產(chǎn)物含量發(fā)酵液固液分離目的產(chǎn)物存在于發(fā)酵液上清中，此步驟主要控制目的產(chǎn)物收率P1純化通過兩步柱層析，分別去除發(fā)酵上清液中的色素和雜蛋白利用紫外檢測儀控制目的產(chǎn)物收率，主要試劑為乙醇與異丙醇P1沉淀、干燥調(diào)節(jié)PH值，使P1沉淀，再經(jīng)離心干燥，得中間體I固體P2純化控溫進行轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，主要試劑為DMSO與1,4-丁二醇 再通過柱層析進行提純，主要試劑為異丙醇P2沉淀、干燥調(diào)節(jié)PH值，使P2沉淀，再經(jīng)離心干燥，得中間體II固體脫帽 通過控制濕度與溫度進行脫帽反應(yīng)，得到終產(chǎn)物胰島素 主要試劑為丙酮，產(chǎn)品為半固體成品粗純化 經(jīng)過兩步柱層析對胰島素進行提純，試劑為Tris

7、-HCl和異丙醇 通過超濾對提純后的胰島素進行濃縮，通過管道傳遞到下工序成品精純化 通過制備色譜對胰島素粗品進行精制，主要試劑為色譜乙腈 然后經(jīng)兩步結(jié)晶后通過管道過濾除菌到百級區(qū)過濾凍干 對胰島素成品進行一次結(jié)晶和水洗 對水洗后的胰島素進行過濾除菌后凍干，即得胰島素成品三、胰島素的發(fā)展歷史及應(yīng)用 糖尿病是歷史悠久的人類疾病，問題出在身體不能利用最重要的能源葡萄糖，以致有大量的葡萄糖堆積在血液，造成血管病變及病菌滋生；同時過多的葡萄糖從尿液流失，帶走大量水分，造成病人又饑又渴。就算吃喝不斷，患者仍然不斷消瘦（蛋白質(zhì)及脂肪都分解用來制造更多的葡萄糖），增加飲食只會使情況變得更糟，因此中醫(yī)稱此疾為“

8、消渴癥”。在長期“饑餓”下，身體組織開始利用酮體；大量由脂肪及胺基酸生成的酮體帶有酸性，而造成患者酸中毒。 在胰島素發(fā)現(xiàn)以前，常用的糖尿病控制方法就是禁食。在每日不到一千大卡的熱量、不含什么碳水化合物的嚴格飲食下，原本已經(jīng)消瘦不堪的糖尿病患者更是骨瘦如材，形同餓莩。這些人的體重可低至二十來公斤，成天躺在床上，連抬個頭的力氣也無。他們就算不死于酸中毒造成的昏迷，遲早也是餓死。這些坐以待斃的悲慘情狀，絕非現(xiàn)代人所能想像。直到上世紀20年代初，糖尿病仍被視為一種令人談虎色變的不治之癥。 胰島素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.貝斯特首先發(fā)現(xiàn)。1923年開始用于臨床，使過去不治的糖尿病患者得

9、到挽救。班廷后來在多倫多大學(xué)與麥克勞德合作，獲得治療糖尿病效果穩(wěn)定的激素。他和麥克勞德兩人因發(fā)現(xiàn)胰島素而共獲1923年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。他將部分獎金分給貝斯特。班廷1941年2月21日在二戰(zhàn)一次執(zhí)行任務(wù)時因飛機失事而遇難，享年50歲。 中國科學(xué)院腎病檢測研究所主治直至80年代初，用于臨床的胰島素幾乎都是從豬、牛胰臟中提取的。不同動物的胰島素組成均有所差異，豬的與人的胰島素結(jié)構(gòu)最為相似，只有B鏈羧基端的一個氨基酸不同。80年代初已成功地運用遺傳工程技術(shù)由微生物大量生產(chǎn)人的胰島素，并已用于臨床。 1955年英國F.桑格小組測定了牛胰島素的全部氨基酸序列，開辟了人類認識蛋白質(zhì)分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的道路。

10、11965年9月17日，中國科學(xué)家人工合成了具有全部生物活力的結(jié)晶牛胰島素，它是第一個在實驗室中用人工方法合成的蛋白質(zhì)。稍后美國和聯(lián)邦德國的科學(xué)家也完成了類似的工作。70年代初期，英國和中國的科學(xué)家又成功地用X射線衍射方法測定了豬胰島素的立體結(jié)構(gòu)。這些工作為深入研究胰島素分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。人們用化學(xué)全合成和半合成方法制備類似物，研究其結(jié)構(gòu)改變對生物功能的影響；進行不同種屬胰島素的比較研究；研究異常胰島素分子病，即由于胰島素基因的突變使胰島素分子中個別氨基酸改變而產(chǎn)生的一種分子病。這些研究對于闡明某些糖尿病的病因也具有重要的實際意義。 九十年來,胰島素的劑型不斷推陳出新,目前已發(fā)展為

11、速效、短效、中效、 長效和預(yù)混胰島素等多種劑型。2從U-40、U-80、U-100等不同濃度,到牛、豬、重組人胰島素等不同來源;從結(jié)晶胰島素、純化胰島素、人工合成胰島素等不同純度到皮下注射、胰島素筆、胰島素泵以及口服、經(jīng)鼻、經(jīng)眼、經(jīng)直腸、經(jīng)皮膚等無創(chuàng)途徑,人類對胰島素探索的腳步從未停歇。讓我們記住這一偉大歷史階段中的重要時刻: 31921年:加拿大科學(xué)家Banting、Best、MacLeod和Collip發(fā)現(xiàn)并提純胰島素。 1922年:胰島素首次應(yīng)用于人類糖尿病的治療。 1923年:胰島素上市。 1926年:美國生化學(xué)家Abel制得胰島素結(jié)晶。 1936年:首個長效胰島素精蛋白鋅胰島素(PZ

12、I)問世。 1946年:中效低精蛋白胰島素問世。 1955年:英國生化學(xué)家Frederick Sanger完成了世界上第一個蛋白質(zhì)(胰島素)的一級結(jié)構(gòu)測定,揭示了胰島素的化學(xué)結(jié)構(gòu),因此榮獲1958年諾貝爾化學(xué)獎。 19631966年:中國、德國和美國科學(xué)家致力于化學(xué)合成胰島素的研究。中國學(xué)者于1965年首次人工合成了具有全部生物活性的結(jié)晶牛胰島素。 1969年:Dorothy Hodgkin 應(yīng)用X線衍射晶體分析法確定了胰島素的三級結(jié)構(gòu)。 1974年:高純度動物胰島素(蛋白雜質(zhì)< 1 pmol/L)研制成功。 1978年:通過重組DNA技術(shù),人胰島素首次在大腸桿菌中合成。 1982年:F

13、DA批準重組人胰島素在美國上市。 1996年:FDA批準首個重組人胰島素類似物賴脯胰島素上市。自此,300 余種胰島素類似物被研制成功,包括70種動物胰島素,80種化學(xué)改良胰島素和150余種生物合成胰島素。 2004年:首個長效重組人胰島素類似物甘精胰島素獲準上市。 2006年:首個吸入型胰島素(Exubera)獲準上市,該藥于2007年撤市。4四、胰島素的發(fā)展前景 九十年來，胰島素的發(fā)展從早期的動物胰島素到人胰島素，直到現(xiàn)在的胰島素類似物，拯救了無數(shù)糖尿病患者的生命。尤其是胰島素類似物的發(fā)現(xiàn)和使用，堪稱胰島素治療的革命。 1. 動物胰島素 動物胰島素在胰島素治療的早期發(fā)揮過重要的作用，然而，

14、由于生物種屬的不同，動物胰島素與人體內(nèi)自然產(chǎn)生的人胰島素在氨基酸結(jié)構(gòu)上存在著差異，部分患者可能產(chǎn)生胰島素抗體，需要更多劑量的胰島素來控制其血糖水平。另外，抗體與胰島素的結(jié)合在時間和數(shù)量上無法預(yù)料，嚴重時可能會導(dǎo)致明顯的血糖波動。 為了得到足夠供應(yīng)眾多糖尿病患者使用的藥用胰島素，科學(xué)家與大型制藥廠合作，成功地發(fā)展了工業(yè)化提取技術(shù)，從屠宰場的牛、豬等動物的胰臟中取得了足夠的原料，解決大量生產(chǎn)的原料來源問題。 早期的動物胰島素有較強刺激性，作用時間短，20世紀30年代后，研究者使用魚精蛋白結(jié)合胰島素，使之作用時間延長，每天只需12次注射即可。在其后的幾十年里，胰島素在世界各地的醫(yī)院使用，取得空前的成

15、效。 2. 人胰島素 正由于上述問題的存在，動物胰島素的生產(chǎn)需要向更安全可靠的人胰島素轉(zhuǎn)換。由于基因重組技術(shù)生物合成的人胰島素結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)胰島素的結(jié)構(gòu)完全相同，因而解決了免疫原性問題，減少了胰島素的不良反應(yīng)。 但人們并沒有停止前進的腳步。雖然人胰島素給糖尿病的治療帶來巨大的幫助，但現(xiàn)有的人胰島素注射后并不能模擬正常人的胰島素分泌。如短效胰島素皮下注射后，由于吸收緩慢，即使餐前30分鐘注射，其胰島素高峰也可能出現(xiàn)延遲。這就導(dǎo)致了餐后高血糖不能及時控制，以及兩餐間有可能發(fā)生低血糖反應(yīng)。另有研究顯示，超過3/4的患者由于感覺不方便，無法在餐前30分鐘注射胰島素，從而使其治療效果不很理想。而中效胰島素

16、注射后具有峰值，存在不能模擬生理的基礎(chǔ)胰島素分泌模式等問題。上述問題的存在，使得胰島素臨床應(yīng)用后并不能達到最佳的治療效果，時常會出現(xiàn)低血糖反應(yīng)和血糖控制欠佳的情況。 20世紀60年代，研究人員又設(shè)法提取人胰島素。因為動物胰島素與人胰島素存在細微差異，抗原性降低了它的效能。但人胰島素的來源數(shù)量有限，不能滿足需要。 到了70年代，研究者突破性地使用生物技術(shù)人工合成了人胰島素。 基因合成的人胰島素與從人體提取的胰島素的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)完全一樣。它是通過生物工程，在基因重組的微生物體內(nèi)合成的，沒有異體抗原性使用非常安全。5 3. 人胰島素類似物應(yīng)運而生 為了解決人胰島素制劑不能很好地模擬生理性胰島素分泌

17、模式問題，具有更佳作用時間和作用效果的人胰島素類似物應(yīng)運而生。20世紀90年代初，大量研究發(fā)現(xiàn)，通過改變胰島素的局部結(jié)構(gòu)，可使其作用時間發(fā)生變化，從而更好地控制血糖。 最新一代的胰島素產(chǎn)品，稱為“基因重組人胰島素類似物”，它將人胰島素的部分氨基酸作了修改，這種修改使其更符合臨床治療的需要。與合成人胰島素一樣，胰島素類似物是通過生物工程合成生產(chǎn)的。2002年，第一個人胰島素類似物在我國上市。 經(jīng)改造的基因胰島素類似物包括速效和超長效胰島素類似物。 速效胰島素類似物以單體胰島素的形式直接入血，因此能夠在注射后迅速被吸收，10分鐘即可起效。作用時間持續(xù)24小時的雄長效胰島素類似物主要用于持續(xù)控制基礎(chǔ)血糖。它可以與速效類似物聯(lián)合使用，能很好地模