實驗五 SDS-PAGE蛋白質電泳膠體制備與蛋白質分析

1、實驗五: SDS-PAGE蛋白質電泳膠體製備與蛋白質分析目的：利用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 具有分開不同大小蛋白質分子的高解析能力之特點。將奈米探針所結合到的蛋白質進行電泳分析，以協(xié)助分辨蝦血中是否有蛋白質結合，並初步估計蛋白質的分子量。材料與設備： Sample Bio-Rad蛋白電泳槽與鑄膠組合 直流電流供應器 染色盤 旋轉搖盪器 玻璃紙與玻璃板 夾子 30% Acrylamide/Bis: 取29.2 g acrylamide加上0.8 g Bis加水溶解至100 ml acrylamide/bis溶液有神經毒性! 不可直接接觸 1.5 M Tris-Cl pH8.

2、8 0.5 M Tris-Cl pH6.8 TEMED (N,N,N',N'-tetramethylethylene; Bio-Rad或Sigma) 10% SDS (Dodecyl sulfate sodium salt) 10% APS (ammonium persulfate): 取0.1 g APS溶於1 ml H2O需使用前才配製 5X running buffer: 72 g glycine, 15 g Tris-base, 5 g SDS/L, pH 8.3 Stain solution: 0.2% coomassie brilliant blue R-250 (

3、CBR), 40% methanol, 10% acetic acid Destain solution: 40% Ethanol, 10% acetic acid 5X SDS-sample buffer: 0.40 M Tris-Cl pH6.8, 0.05% bromophenol blue, 10 % SDS, 10% b-mercaptoethanol, 75% glycerol 標準蛋白質組合試劑 (prestained protein marker)方法與步驟：A. SDS平板膠片鑄造1. 洗淨兩組玻璃片組合（0.75 mm厚），再用酒精拭淨待乾後，將其組合直立於鑄膠器上。2.

4、準備分離膠體 (separating gel) 溶液，兩片需配製10 ml。分離膠體12% 10 mlddH2O 3.3 ml1.5M Tris-Cl pH8.8 2.5 ml10% SDS 100 l30% Acrylamide/Bis 4 ml10% APS 100 lTEMED 4 l以上各成份需按順序先後加入小燒杯中，混合均勻後，可直接沿著玻璃片一側，慢慢加至鑄膠組合到預定高度（約3/4高度），勿陷入氣泡，再輕輕加上一層75%酒精。3. 約3060分鐘後，分離膠體可凝結，則準備濃縮膠體 (stacking gel) 溶液。濃縮膠體5% 5 mlddH2O 3.4 ml1 M Tris-

5、Cl pH6.8 0.67 ml10% SDS 50 l30% Acrylamide/Bis 0.83 ml10% APS 50 lTEMED 5 l按順序將各成份置於小燒杯中，混合均勻後，將已凝結之分離膠體的上層水層去除，再加入濃縮膠體溶液需加到滿。4. 儘快地插入樣品槽齒模，注意不可有氣泡陷入膠體中。約30分鐘後，濃縮膠體可凝結，取下齒模，以ddH2O清洗樣品槽後即可使用。B. 電泳方法1. 洗淨樣品槽後，即可架至電泳槽內，並注滿1X running buffer。2. 將各步驟純化之蛋白質溶液取適量與1X SDS-sample buffer，混勻後於95oC加熱25分鐘。3. 冷卻後快速

6、短暫離心 (spin down) 即可，以微量吸管吸取15 l，依次注入樣品槽中。4. 裝上電源蓋，以70V 10 min再以100V進行電泳，待追蹤染劑 (tracking dye)藍色細線泳動到底邊(約1.5小時)即可終止電泳。5. 除去電源蓋取出膠片組合，置於染色盤，繼續(xù)膠片染色方法。B. 膠片染色法3. 染色盤中的膠片倒入CBR染色液，置於旋轉搖盪器上，慢速在室溫shake染色60分鐘。4. 染色後先以少量脫色液清洗膠片，再加入較大量脫色液脫色，直到膠片的藍色背景漸漸退去。約每20分鐘更換一次脫色液，大概三次後可見蛋白質的清晰藍色色帶出現(xiàn)。C. 膠片乾燥法1. 把玻璃紙先用水浸濕，平鋪在乾燥用的玻璃片上，玻璃紙需比玻璃片稍大，因此四周會有多出的部份。2. 把膠片平鋪在玻璃紙中央，膠片與玻璃紙間不可有任何氣泡。3. 在膠片上再加上一層浸濕玻