大腸桿菌生產(chǎn)制備重組人胰島素工藝

1、1. 提取目的基因：既從人的DNA中提取胰島素基因,可使用限制性內(nèi)切酶將目的基因從原 DNA中分離2. 提取質(zhì)粒：使用細(xì)胞工程，培養(yǎng)大腸桿菌，從大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中提取質(zhì)粒，質(zhì)粒為環(huán)狀DNA.3. 基因重組：取出目的基因與質(zhì)粒，先利用同種限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒切開，再使用DNA連接酶 將目的基因與質(zhì)粒"縫合",形成一個(gè)能表達(dá)出胰島素的DNA質(zhì)粒.4. 將質(zhì)粒送回大腸桿菌：再大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有 Ca+勺物質(zhì)，如CaCI2,這使細(xì)胞會(huì)吸收外源基因. 此時(shí)將重組的質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中，大腸桿菌便會(huì)將重組質(zhì)粒吸收.5. 胰島素的產(chǎn)生：再大腸桿菌內(nèi)，質(zhì)粒通過表達(dá)轉(zhuǎn)錄與翻譯后，便產(chǎn)生出

2、胰島素蛋白質(zhì)通過大腸桿 菌的大量繁衍，便可大量生產(chǎn)出胰島素！學(xué)習(xí)要求知道DNA勺粗提取與鑒定的原理；掌握并能分析DNAE提取的技術(shù) 方法和要求；學(xué)會(huì)DNA分子的鑒定方法【預(yù)習(xí)指導(dǎo)】在課前時(shí)間通過閱讀教材、同學(xué)交流和討論，完成下列問題，并 初步鞏固。、基礎(chǔ)知識(shí)【活動(dòng)1】閱讀教材P54 “基礎(chǔ)知識(shí)”，討論并回答下列問題：1. （記憶）提取生物大分子的基本思路是利用它們的理化性質(zhì)的不同進(jìn)行分離。2. （記憶）DNA的溶解性特點(diǎn)：DNA在不同濃度_NaCI溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白質(zhì)溶于酒精?！舅伎?】據(jù)圖5- 1分析：DNA在不同濃度NaCI溶液中溶解度有何特點(diǎn)？在 O.14mol/L

3、時(shí)溶解度最小;要使DNA溶解，需要使用什么濃度？較高濃度，可使 DNA溶解；要使DNA析出，又需要使用什么濃度？ 0.14mol/L可使DNA析出?！舅伎?】利用DNA不溶于酒精的原理，可以達(dá)到將_DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離目 的。3. （記憶）DNA勺耐受性特點(diǎn)：蛋白酶能分解蛋白質(zhì)而不能分解 DNA在6080C時(shí)蛋白質(zhì)變性沉淀而 DNA 分子不變性。洗滌劑能與蛋白質(zhì)結(jié)合瓦解細(xì)胞膜而不破壞DNA分子。4. （記憶）DNA的鑒定原理當(dāng)鑒定提取出的物質(zhì)是否是 DNA寸，需要使用二苯胺（甲基綠）進(jìn)行鑒定。在沸水浴條件下，該試劑與 DNA反應(yīng)，呈現(xiàn)（淺）藍(lán)色。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)【活動(dòng)2】閱讀教材P55 “實(shí)驗(yàn)

4、設(shè)計(jì)”，討論并回答下列問題：1. （記憶）實(shí)驗(yàn)材料的選?。哼x取材料時(shí)應(yīng)本著 DNA含量高、材料易得、便于 提取的原則?！舅伎?】你認(rèn)為教材提供的材料中哺乳動(dòng)物的血液不適合提取DNA2. （記憶）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液：雞血：向雞血細(xì)胞液中加入一定量蒸餾水并玻棒攪拌，用紗布過濾后，收集 濾液。洋蔥：向研缽中加入一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，用紗布過濾后，收集 濾液?！舅伎?】在以上實(shí)驗(yàn)中，蒸餾水的作用是使血細(xì)胞大量吸水而脹裂，洗滌劑的 作用是瓦解細(xì)胞膜，食鹽的作用是溶解_DNA物質(zhì)。3.（學(xué)會(huì)）去除濾液中的雜質(zhì)：方案一:30mL濾液一加NaCI使DNA溶解一過濾得濾液一加蒸餾水使 DNA析

5、 出過濾得過濾物放到2mol/LNaCI溶液中溶解DNAr NaCI溶解液萬案二:30mL濾液一加嫩肉粉（木瓜蛋白酶）-靜置 10分鐘一得DNA濾液萬案三：30mL濾液6067C處理過濾得 DNA濾液【思考5】以上三個(gè)方案的原理分別是什么？方案一原理：DNA在不同濃度_NaCI溶液中溶解度不同;方案二原理：蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解_ DNA方案三原理：DNA耐高溫而蛋白質(zhì)不耐高溫。【思考6】方案一中：“加NaCI使DNA溶解-過濾得濾液”的目的是除去不溶（可溶、不溶）于NaCI溶液中的細(xì)胞雜質(zhì)；“加蒸餾水使 DNA析出一過濾得 過濾物”的目的是除去可溶（可溶、不溶）于 NaCI溶液中的細(xì)胞雜質(zhì)

6、。4. （記憶）DNA勺析出：DNA濾液與等體積冷卻酒精混合，靜置一段時(shí)間后析出的白色絲狀物就是 DNA5. （記憶）DNA勺鑒定：取2支潔凈的試管，編號(hào)甲、乙，各加入等量的 2mol/L_NaCI_溶液。甲中放 入少量白色絲狀物，使之溶解。在甲、乙試管中各加 4mL二苯胺，混合均勻。沸 水浴5min，觀察顏色變化，甲試管呈現(xiàn)藍(lán)色。三、操作提示【活動(dòng)3】（記憶）閱讀教材P56 “操作提示”和P57 “課題延伸”，關(guān)注下列 注意事項(xiàng)：1. 在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心后除去血漿，以提高細(xì)胞懸液濃度。2. 實(shí)驗(yàn)中使用塑料燒杯和尼龍布，以免 DNA被吸附。3. 玻棒沿同一方向緩慢攪拌

7、（細(xì)胞破裂時(shí)快速攪拌），玻棒不要碰到燒杯壁。_4. 二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配。5為提高DNA純度，實(shí)驗(yàn)中通常使用的洗滌劑有 CTAB SDS等。【活動(dòng)4】觀看視頻：觀看“ DNA勺粗提取與鑒定”視頻，體會(huì)并學(xué)會(huì)相關(guān)技術(shù) 方法。課后學(xué)習(xí)1. 嘗試從植物組織中提取DNA分子。2 基礎(chǔ)訓(xùn)練冊：將基礎(chǔ)知識(shí)整理到作業(yè)本上；完成該節(jié)訓(xùn)練題。學(xué)習(xí)要求嘗試PCR技術(shù)的基本操作，體驗(yàn)PCF技術(shù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法；理解PCF技術(shù) 的原理；討論P(yáng)CR技術(shù)的應(yīng)用【預(yù)習(xí)指導(dǎo)】在課前時(shí)間通過閱讀教材、同學(xué)交流和討論，完成下列問題，并 初步鞏固。一、基礎(chǔ)知識(shí)【活動(dòng)1】閱讀教材P58 “PCF原理”，討論并回答下列問題：1.

8、（記憶）PCF技術(shù)擴(kuò)增DNA勺過程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程類似?！舅伎?】填寫下表：（記憶）細(xì)胞內(nèi)DNAM制條件分析條件參與的組分在DNA分子復(fù)制中的作用模板DNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料解旋酶打開DNA雙螺旋酶RNA聚合酶合成RNA引物DNA聚合酶催化合成DNA子鏈；切除引物DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來能量ATP為解螺旋和合成子鏈提供能量引物RNA為DNA聚合酶提供合成的3'端起點(diǎn)2. (理解)細(xì)胞內(nèi)DNA勺復(fù)制(1) DNA勺結(jié)構(gòu)：脫氧核苷酸分子通過 3,5 -磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長鏈, 兩條脫氧核苷酸長鏈反向平行排列并螺旋化，

9、形成DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。(2) DNA的勺復(fù)制：首先，在解旋酶的作用下，由 ATP供能，DNA發(fā)生解旋形成兩條DNA單鏈。其次，在DNA單鏈的3'端，在RNA聚合酶在作用下，合成RNA 引物。再次，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'端開始合成DNA子鏈。 最后，DNA聚合酶將引物切去，并合成空缺處 DNA單鏈，再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來3. (記憶)DNA分子復(fù)制的人工控制解開螺旋：在80100C時(shí)，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性?；謴?fù)螺旋：在5060C左右時(shí)，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為復(fù) 性。復(fù)制條件：緩沖液，DNA模板、四種脫氧

10、核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種引 物。控制儀器：PCF儀（溫度周期性自動(dòng)調(diào)節(jié)儀）?！舅伎?】緩沖液相當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的什么成分？核液【活動(dòng)2】閱讀教材P59 “PCF的反應(yīng)過程”，討論并回答下列問題:1. （記憶）填寫PCR反應(yīng)流程:2. （理解）PCF反應(yīng)過程是：在升溫至90C以上時(shí)DNA解旋；在降溫至_50°C左 右時(shí)引物與DNA單鏈結(jié)合；在升溫至72C左右時(shí)合成DNA子鏈。、實(shí)驗(yàn)操作【活動(dòng)3】閱讀教材P62 “實(shí)驗(yàn)操作”，討論并回答下列問題：1. （記憶）在PCF反應(yīng)體系的配方中，含有的成分有緩沖液、DNA模板、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物、水。2. （了解）實(shí)

11、驗(yàn)操作步驟：按照PCF反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液；將 PCF反應(yīng)體系50卩L用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5mL）中；將微量離心管放到PCR儀中；設(shè)置PCF儀的工作參數(shù)；DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。3. （了解）水浴法：將微型離心管依次在 95C、55C、72C恒溫水浴鍋中循環(huán)處理。三、操作提示【活動(dòng)4】閱讀教材P62 “操作提示”，討論并回答下列問題：1. （記憶）避免外源_DNA虧染，所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。2. （記憶）將緩沖液和酶分裝成小份，20 C低溫保存。3. （記憶）每添加一種反應(yīng)成分，更換一個(gè)移液器槍頭。4. （記憶）混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)【活動(dòng)4】閱讀教材P63 “結(jié)果分析與評(píng)價(jià)”，討論并回答下列問題：1. （記憶）反應(yīng)液稀釋：取2?LPCR反應(yīng)液，添加98?L蒸餾水。2. （記憶）分光光度計(jì)調(diào)零：將100?L蒸餾水添加到比色杯中，在 260nm處將分光光度計(jì)讀數(shù)調(diào)節(jié)為零。3. （記憶）將100?L反應(yīng)稀釋液倒入比色杯中，測定在 260nm處的光吸收值。4