羥基喜樹堿轉(zhuǎn)鐵蛋白隱形納米泡囊的制備和體內(nèi)外評(píng)價(jià)

1、羥基喜樹堿轉(zhuǎn)鐵蛋白隱形納米泡囊的制備和體內(nèi)、外評(píng)價(jià)洪鳴凰，裴元英基金項(xiàng)目: 國(guó)家基礎(chǔ)研究973項(xiàng)目（2007CB935802）及國(guó)家自然科學(xué)基金（30572266）資助項(xiàng)目作者簡(jiǎn)介: 洪鳴凰,女,博士 通訊作者: 裴元英,博士生導(dǎo)師 Tel E-mail: yypei（復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200032） 摘要：目的 以羥基喜樹堿（hydroxycamptothecin, HCPT）為模型藥物，制備轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin, Tf）修飾隱形納米泡囊，探索聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾的隱形化效果與Tf修飾的主動(dòng)靶向相結(jié)合，有

2、效遞送藥物到達(dá)腫瘤部位的可行性。 方法 以人工合成的聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯（PEG-PHDCA）為表面修飾材料，共價(jià)連接氧化的Tf，采用薄膜水化-超聲分散法制備載HCPT隱形納米泡囊（Tf-PEG-NS），考察粒徑、包封率、體外釋放、細(xì)胞毒性、細(xì)胞攝取和細(xì)胞內(nèi)分布，大鼠藥動(dòng)學(xué)和S180荷瘤小鼠體內(nèi)組織分布，抗腫瘤療效。 結(jié)果 Tf-PEG-NS粒徑為116nm，包封率為(93.000.38)%，體外釋放48h達(dá)90%。體外KB細(xì)胞對(duì)Tf-PEG-NS的攝取呈現(xiàn)濃度與時(shí)間依賴性，且在低溫條件或者過量Tf的存在下，攝取受到抑制。與市售注射劑、普通泡囊和PEG修飾泡囊（PEG-NS）相比，

3、Tf-PEG-NS對(duì)KB、K562、S180三種腫瘤細(xì)胞毒性最強(qiáng)；胞內(nèi)藥物攝取量，尤其是細(xì)胞核內(nèi)最多；腫瘤部位藥時(shí)曲線下面積最大；抗腫瘤活性最強(qiáng)，對(duì)S180荷瘤小鼠的腫瘤抑制率達(dá)71%。結(jié)論 所制備的轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾隱形納米泡囊可作為有效的載體遞送HCPT至腫瘤細(xì)胞發(fā)揮療效。關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)鐵蛋白；羥基喜樹堿；非離子表面活性劑泡囊；聚乙二醇；腫瘤靶向Preperation of Transferrin Modified Hydroxycamptothecin Loaded PEGylated Niosomes and Its Evaluation in Vitro and in VivoHONG Min

4、g-huang, PEI Yuan-ying( School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 200032,China)ABSTRACT：OBJECTIVE To exploit the possibility of combination of the stealth action by polyethylene glycol cyanoacrylate-co-hexadecyl cyanoacrylate (PEG-PHDCA) modified niosomes and active targeting function of transf

5、errin (Tf) by transferrin receptor-mediated endocytosis to promote drug delivery to solid tumor following intravenous administration with hydroxycamptothecin (HCPT) as model drug. METHODS HCPT-loaded PEG-niosomes (PEG-NS) were prepared by thin-film hydration and ultrasound method; Tf was coupled to

6、terminal amino group of PEG to produce the active targeting vesicles (Tf-PEG-NS). The particle sizedistribution, entrapment rate, in vitro release, cytotoxicity, cell uptake, intracellular drug distribution, in vivo pharmacokinetics in rats, tissue distribution and antitumor effect in S180 tumor mic

7、e model were determined. RESULTS The prepared Tf-PEG-NS with average diameters of 116nm showed sustained release profile in vitro. The uptake of Tf-PEG-NS into KB cells was concentration and time dependent, which could be inhibited by low temperature and free Tf. Compared with HCPT injection, nonste

8、alth niosomes and PEG-NS, Tf-PEG-NS demonstrated the strongest cytotoxicity to three carcinomatous cell lines (KB, K562 and S180 cells), the greatest intracullar uptake especially in nuclei, the highest tumor concentration and largest area under the intratumoral hydroxycamptothecin concentration cur

9、ve, as well as the most powerful antitumor activity with the inhibition rate of 71% against S180 tumor in mice. CONCLUSION The transferrin modified PEGylated niosomes could be one of the promising solutions to delivery anti-tumor drugs to tumor. KEY WORDS: transferrin; hydroxycamptothecin; niosomes;

10、 polyethylene glycol; tumor targeting 非離子表面活性劑泡囊(non-ionic surfactant vesicles，niosomes)是由合成的非離子表面活性劑在水性介質(zhì)中組成單室或多室封閉雙層結(jié)構(gòu)的有序組織聚集體，簡(jiǎn)稱泡囊。由非離子表面活性劑替代磷脂而形成的泡囊相比于脂質(zhì)體，具有成分確定、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易于保存、成本低、無毒性及不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。然而，作為膠體載藥系統(tǒng)，泡囊靜脈注射后會(huì)被單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）攝取而快速清除。采用親水性高分子材料,如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修飾制備隱形納米載藥體系,可以避免MPS的吞

11、噬,延長(zhǎng)藥物在血液循環(huán)系統(tǒng)中的滯留時(shí)間,進(jìn)而通過EPR效應(yīng)富集于腫瘤組織。用具有腫瘤靶向性的頭基修飾泡囊，可以進(jìn)一步提高抗腫瘤藥物的療效。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，使其作為靶點(diǎn)介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到增值細(xì)胞內(nèi)成為可能1,2。本實(shí)驗(yàn)室前期成功合成了轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚乙二醇-腫瘤壞死因子共軛物(Tf-PEG-TNF-)3，其與腫瘤細(xì)胞表面TfR的結(jié)合常數(shù)與游離Tf相似。共軛物血漿半衰期較原藥明顯延長(zhǎng)，腫瘤蓄積量增加，抗癌活性分別是TNF-和PEG-TNF-的5.3和1.8倍。近年來，已有Tf-藥物共軛物4、Tf-脂質(zhì)體5、納米粒6、樹突狀聚合物7等研究，但未見轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾非離子表面活性劑泡囊的報(bào)導(dǎo)。

12、羥基喜樹堿（hydroxycamptothecin, HCPT）是喜樹中分離提取的同類抗腫瘤單體中抗癌作用最強(qiáng)的微量生物堿。臨床主要運(yùn)用于消化系統(tǒng)癌癥；對(duì)口腔、頸面部癌、頭頸部圓柱型腺癌及膀胱癌也有較好療效。但是， HCPT存在半衰期短（5-30min左右），脂溶性和水溶性均差，穩(wěn)定性差以及毒副作用大等缺點(diǎn)，其臨床應(yīng)用受到一定的限制。本課題組前期工作 8以span60和膽固醇為載體，聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(MePEG-PHDCA)為膜表面修飾材料，制備了HCPT隱形納米泡囊。結(jié)果表明: 粒徑在90nm左右MePEG5 000-PHDCA載藥納米泡囊具有最佳的腫瘤靶向、規(guī)避肝脾作用和抑

13、癌作用。在此基礎(chǔ)上，本文以Tf為靶向頭基，制備了載HCPT的主動(dòng)靶向隱形納米泡囊，進(jìn)行體外藥物釋放、細(xì)胞毒以及亞細(xì)胞器（包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核）藥物經(jīng)時(shí)分布評(píng)價(jià)，大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)、荷瘤小鼠組織分布、抗腫瘤療效，并與未修飾泡囊和HCPT注射劑進(jìn)行比較，來探索以泡囊為載體，用PEG修飾的隱形化效果與Tf修飾的主動(dòng)靶向相結(jié)合，有效遞送藥物到達(dá)腫瘤部位的可行性。1 材料與儀器1.1 材料 -t-叔丁氧羰基氨基-羥基聚乙二醇(Boc-NH-PEG-OH, MW 5,000)（德國(guó)Iris Biotech GmbH公司）；羥基喜樹堿（上海駿杰生物技術(shù)有限公司）；羥基喜樹堿注射液（湖北黃石藥業(yè)有限公司）；NH2-

14、PEG-PHDCA 、MePEG-PHDCA 與PHDCA（本實(shí)驗(yàn)室自制）；司盤60、膽固醇（中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司）；甲氧基聚乙二醇 (MePEG, MW 5, 000)、Holo-Transferrin、苯甲基磺酰氟（美國(guó)Sigma公司）；人轉(zhuǎn)鐵蛋白ELISA定量試劑盒(美國(guó)Bethyl公司)；Sepharose CL-4B（瑞典Pharmacia公司)；胎牛血清（杭州四季青公司）；RPMI 1640、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；MTT（美國(guó)Amresco公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Rockford公司）；其余試劑均為分析純。1.2 細(xì)胞 人慢性髓性白血病K562細(xì)胞、

15、人口腔表皮樣癌KB細(xì)胞、小鼠艾氏腹水瘤S180細(xì)胞、正常人肝L02細(xì)胞（中科院上海生物細(xì)胞學(xué)研究所）1.3 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠(20020 g)和昆明小鼠(202 g)（復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部）1.4 儀器 UV-2401PC紫外分光光度儀(日本Shimadzu公司)；NICOMPTM380 ZLS粒度/zeta電位測(cè)定儀(美國(guó)NICOMP公司)；Mercury Plus 400MHz核磁共振儀（美國(guó)Varian公司）；LC-10AT SPD-10A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；1100 Series熒光高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；ELX800酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio

16、-TeK公司）。2 方法2.1 HCPT納米泡囊的制備及表征 在本實(shí)驗(yàn)室前期基礎(chǔ)上8，采用薄膜水化-超聲分散法制備未修飾的PHDCA泡囊（n-NS）和PEG修飾泡囊（PEG-NS）。主動(dòng)靶向泡囊的制備參考文獻(xiàn)9，并加以改進(jìn)。首先以 NH2-PEG-PHDCA為修飾材料，制備隱形納米泡囊（NH2-PEG-NS）。另將Tf 100mg溶于HEPES緩沖液（HBS，150mM NaCl，20mM HEPES，pH 7.4, NaIO4 4mg溶于醋酸鈉緩沖液（30mM，pH5），混合后于暗處、冰浴條件下反應(yīng)90min，經(jīng)Sephadex G-25 PD 10柱、HBS洗脫，于280nm處監(jiān)測(cè)得到氧化

17、轉(zhuǎn)鐵蛋白。超濾離心管（MWCO 3,000）離心10min濃縮后，迅速加入至 NH2-PEG-NS（按照摩爾比 PEG：Tf=2：1），室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h后，以HBS洗脫過Sepharose CL-4B凝膠柱，于280nm處監(jiān)測(cè)，除去未連接蛋白，即得HCPT的主動(dòng)靶向隱形納米泡囊（Tf-PEG-NS）。采用Tf ELISA定量試劑盒測(cè)定總Tf個(gè)數(shù)，比濁法測(cè)定泡囊個(gè)數(shù)，兩者之比即為平均每個(gè)泡囊表面的Tf連接個(gè)數(shù)10。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室原有方法29測(cè)定Tf-PEG-NS、PEG-NS和n-NS的粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量。2.2 體外釋放度實(shí)驗(yàn) 采用轉(zhuǎn)籃法考察HCPT溶液、Tf-PEG-NS、PE

18、G-NS和NS在等滲PBS（pH 7.4）的釋放度。2.3 體外細(xì)胞毒 考察不同制劑，包括HCPT注射劑、Tf-PEG-NS、PEG-NS以及n-NS的細(xì)胞毒性。K562、KB、S180、L02細(xì)胞以1104個(gè)/孔接種于96孔板，37培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的各種制劑（30.00，25.00，12.50，6.50，3.00，1.50，0.75，0.50gmL-1），繼續(xù)培養(yǎng)24h后，采用MTT 法測(cè)得IC50。2.4 細(xì)胞攝取 KB細(xì)胞以1105個(gè)/孔接種于24孔培養(yǎng)板，37培養(yǎng)24h后，分別加入濃度為15gmL-1的HCPT注射劑、Tf-PEG-NS、PEG-NS以及n-NS 各0.3

19、mL，繼續(xù)孵育，于不同時(shí)間點(diǎn)（0.25，0.5，1，2，4h）取出。冰磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）洗滌三遍，消化，3 000 rmin-1離心5min收集細(xì)胞，再用PBS 3mL洗滌三次，1% Triton X-100 0.4 mL孵育過夜。離心除去細(xì)胞碎片，采用熒光-HPLC測(cè)定細(xì)胞裂解液中的藥量，BCA試劑盒測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度，攝取程度表示為 HCPT(ng)/蛋白量(mg)。同法考察4孵育，或者過量Tf存在，或者不同HCPT濃度(0.5, 1, 2.5, 5, 15, 30 gmL-1)于37孵育1h條件下的細(xì)胞攝取程度。2.5 亞細(xì)胞器藥物分布 參考文獻(xiàn)11并加以改進(jìn)。KB細(xì)胞以1

20、106個(gè)/孔接種于100mm培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)12h后，分別加入濃度為100gmL-1的HCPT注射劑、Tf-PEG-NS、PEG-NS以及NS 各1mL，繼續(xù)孵育，于不同時(shí)間點(diǎn)（0.5，1，2，4，8，12h）取出，PBS洗滌三遍，消化，3 000 rmin-1離心5min收集細(xì)胞，再用PBS 3mL洗滌三次，沉淀用TM-2緩沖液（0.01M Tris-HCl，pH7.4，0.002M MgCl2，0.0005M 苯甲基磺酰氟）300L重懸，室溫下靜止1min后，冰浴5min，繼而加入Triton X-100 1.5L，冰浴5min，于4，800 rmin-1離心10min，上清液用于檢測(cè)細(xì)胞

21、質(zhì)中藥物含量，沉淀用TM-2緩沖液 1mL重懸后用于檢測(cè)細(xì)胞核中藥物含量。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白含量采用BCA試劑盒測(cè)定。 2.6 大鼠體內(nèi)血漿藥動(dòng)學(xué)24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為四組,按組別尾靜脈分別注射市售HCPT注射劑、Tf-PEG-NS、PEG-NS以及NS, 劑量為0.8mgkg-1。給藥后分別于0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 h于眼底取血，采用熒光-HPLC測(cè)定血藥濃度。2.7 S180荷瘤小鼠體內(nèi)組織分布和抗腫瘤藥效學(xué)采用Iodogen 法制備125I-HCPT。S180荷瘤小鼠隨機(jī)分為四組，按組別尾靜脈分別注射市售HCPT注射劑、

22、Tf-PEG-NS、PEG-NS以及NS, 劑量為1mgkg-1(12.5 Ci)。給藥后分別于0.5, 2, 4, 8, 12, 24 h取血后處死，取腫瘤、心、肝、脾、肺、腎、腦，稱重，測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算相對(duì)攝取率(% ID/g)。 昆明小鼠接種S180瘤24小時(shí)后隨機(jī)分為5組，陰性對(duì)照組給予生理鹽水,其余4組HCPT制劑按1mgkg-1連續(xù)靜脈給藥7天。停藥24h后處死動(dòng)物，稱體重、瘤重，求出腫瘤抑制率。并以4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行腫瘤組織病理組織學(xué)觀察。2.8 統(tǒng)計(jì)分析 抗腫瘤藥效學(xué)結(jié)果采用ANOVA檢驗(yàn)，其余數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)判斷差異的顯著性，結(jié)

23、果以表示，P PEG-NSn-NS注射劑；而對(duì)于正常細(xì)胞，毒性差異不明顯。表2 HCPT制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞毒性 IC50值(n = 3)Tab. 2 The IC50 values of HCPT preparations against carcinomatous and normal cell lines (n = 3)Injection(ug/ml)n-NS(ug/ml)PEG-NS(ug/ml)Tf-PEG-NS(ug/ml)K5625.384.740.623027.2429.9326.053.3 細(xì)胞攝取 KB細(xì)胞對(duì)泡囊的攝取呈現(xiàn)濃度依賴性，并隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，攝取量增加(Fi

24、g. 2A, B)。與PEG-NS相比，Tf-PEG-NS的攝取速度快，程度大。與37C 相比，4C孵育時(shí)細(xì)胞對(duì)Tf-PEG-NS的攝取程度有顯著性下降，僅為4C的26.72%（P 0.01，固定給藥濃度15 mgmL-1）。游離Tf (1 mgmL-1)能顯著抑制攝取，孵育1h后攝取量為無游離Tf的52.04%（P 0.01）。對(duì)于PEG-NS，4C的攝取量為37C的 26.72% (P 0.05)。圖 2 KB細(xì)胞對(duì)Tf-PEG-NS和 PEG-NS的攝取. A, 不同濃度37C or 4C條件下孵育1h. B, 固定濃度(15 g/ml)， 37C條件下孵育不同時(shí)間. C, 固定濃度(1

25、5 g/ml)，游離Tf(1 mg/ml)存在或4C孵育1h。n = 3,*P 0.05, * P 0.01 vs. Tf-PEG-NS (37C), # P 0.05, # P 0.01 vs. PEG-NS (37C).Fig. 2 The uptakes of niosomes Tf-PEG-NS and PEG-NS on KB cells. A, uptake of Tf-PEG-NS and PEG-NS (0.5-30 g/ml) at 37C or 4C incubation for 1 hour, respectively. B, uptake of Tf-PEG-NS an

26、d PEG-NS (15 g/ml) at 37C incubation for different time. C, the relative uptake of Tf-PEG-NS or PEG-NS (15 g/ml) at 4C and with or without free Tf (1 mg/ml) at 37C incubation for 1 hour, respectively. n = 3,*P 0.05, * P 0.01 vs. Tf-PEG-NS (37C), # P 0.05, # P 脾 肝肺腎心腦。12h時(shí)，無論與其他制劑或是與其他臟器相比，Tf-PEG-NS組

27、在腫瘤的藥物濃度也是最高。圖5C顯示了不同HCPT制劑在腫瘤部位的藥時(shí)曲線。Tf-PEG-NS組峰濃度最高，分別為注射劑、n-NS和PEG-NS的4.00, 2.88和1.51倍；藥時(shí)曲線下面積最大，分別為注射劑、n-NS和PEG-NS的16.97, 3.32和1.45倍。將藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)一步處理，采用相對(duì)攝取率（Re）和峰濃度比（Ce）來進(jìn)行腫瘤靶向性評(píng)價(jià)（表4），其規(guī)律為：Tf-PEG-NSPEG-NSn-NS。表 3 HCPT泡囊與注射劑的相對(duì)攝取率（Re）和峰濃度比（Ce）(n = 3)Tab. 3 The relative tumor tissue exposures (Re) and

28、 the ratios of HCPT peak concentrations (Ce) in tumor of niosomes compared with HCPT injection (n = 3)n-NSPEG-NSTf-PEG-NSRe5.1111.7316.97Ce1.402.644.00圖 5 HCPT 注射劑, n-NS, PEG-NS 和 Tf-PEG-NS給藥4h(A)和12h(B)組織分布. C, 腫瘤部位的藥物濃度-時(shí)間曲線. n = 3, .Fig. 5 Tissue distributions of HCPT injection and n-NS, PEG-NS,

29、Tf-PEG-NS at 4 hours (A) and 12 hours (B) after administration. C, HCPT level vs. time curves in S180 tumors of mice following intravenous administration of HCPT preparations. n = 3, .3.7 體內(nèi)抗腫瘤藥效泡囊的體內(nèi)抗腫瘤藥效試驗(yàn)結(jié)果如圖6，表4所示，療程結(jié)束后，陰性對(duì)照組的平均瘤重為0.68g，而Tf-PEG-NS組僅為0.200.04 g，顯著輕于注射劑組 ( 0.48 g, P 0.01 ), n-NS組

30、( 0.44 g, P 0.01 ) 和 PEG-NS組 ( 0.37 g, P 0.01)。腫瘤抑制率達(dá)71%，分別為PEG-NS，n-NS和注射劑的1.55, 2.00和2.40倍，療效有顯著性提高，未見明顯的毒副作用。圖6 HCPT 注射劑, n-NS, PEG-NS 和 Tf-PEG-NS治療后腫瘤大小.Fig 6 Tumor growth after systemic application of HCPT injection,n-NS,PEG-NS and Tf-PEG-NS. 表 4 HCPT注射劑和泡囊的S180荷瘤小鼠體內(nèi)抗腫瘤藥效Tab. 4 Antitumor Effec

31、ts of HCPT and HCPT loaded niosomes against sarcoma 180 tumor in miceDoseNumber of animalsBody weight(g)Tumor weight(g)Inhibition%(mg/kg)InitialFinalInitialFinalmeanSDSaline-202021.828.490.680.14-HCPT17101021.4928.180.480.0329n-NS17101021.4228.320.440.0235PEG-NS17101021.628.420.370.0346Tf-PEG-NS1710

32、1021.5128.090.200.0471腫瘤組織病理組織觀察顯示（圖7）：生理鹽水陰性對(duì)照組腫瘤組織中癌細(xì)胞豐富,核大深染,腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,有較多核分裂像,呈卵圓形、梭形、三角形及不規(guī)則形,呈淡藍(lán)色,大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)有1個(gè)核,部分細(xì)胞內(nèi)有2個(gè)或以上的核，胞漿較少。采用HCPT制劑治療后，腫瘤組織有著不同程度的壞死。尤其是Tf-PEG-NS組的腫瘤組織大片壞死,正常結(jié)構(gòu)消失。癌細(xì)胞數(shù)量減少，胞漿較豐富，呈淡紅色，可見核濃縮、核碎裂，濃縮的染色質(zhì)可圍繞于核周邊或形成新月體結(jié)構(gòu)。圖7 生理鹽水(A), HCPT injection (B), n-NS (C), PEG-NS (D)和Tf-PEG-

33、NS (E) 治療后腫瘤部位病理切片.Fig. 7 HE sections of tumor after systemic application of saline (A), HCPT injection (B), n-NS (C), PEG-NS (D) and Tf-PEG-NS (E). 4 討論在治療疾病的過程中，為了提高藥物療效，降低其毒副作用和減少藥源性疾病，將藥物定向濃集于靶器官、靶組織、靶細(xì)胞的靶向給藥系統(tǒng)已成為現(xiàn)代藥劑學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，其關(guān)鍵在于尋找合適的靶頭。轉(zhuǎn)鐵蛋白作為內(nèi)源性蛋白具有無毒、無免疫原性、可生物降解等特點(diǎn)，因而備受青睞12。轉(zhuǎn)鐵蛋白連接到微粒表面常見的方法有

34、戊二醛交聯(lián)法、轉(zhuǎn)鐵蛋白巰基化以及轉(zhuǎn)鐵蛋白氧化等，前兩種方法分別以轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上的氨基和二硫鍵為反應(yīng)部位，存在著反應(yīng)位點(diǎn)不明確的問題。本文采用高碘酸鹽氧化法具有顯著的優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)門f通過糖基化作用部位上的糖苷鍵與NH2-PEG-NS反應(yīng), 已證明該糖基不影響Tf與TfR的結(jié)合。而且，伸出的糖基鏈增加Tf同泡囊表面的距離，降低與受體結(jié)合的位阻，從而保證Tf的結(jié)合活性損失最低。與PEG-NS，n-NS相比，Tf-PEG-NS具有最強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒性。Tf-PEG-NS、PEG-NS的細(xì)胞攝取都能被低溫所抑制，證明泡囊的內(nèi)吞是一個(gè)能量依賴的過程。Tf-PEG-NS的細(xì)胞結(jié)合（4C，不內(nèi)化）和蓄積(37

35、C, 內(nèi)化)都要高于PEG-NS。游離Tf能顯著抑制Tf-PEG-NS的攝取，證明Tf-PEG-NS是通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞入胞。而且，細(xì)胞內(nèi)藥物分布實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Tf-PEG-NS組細(xì)胞核中藥物水平最高，這對(duì)于HCPT療效的發(fā)揮是很有利的，因?yàn)镠CPT是作用于細(xì)胞核中的Topo-而抑制腫瘤的。與體外細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果一致，Tf修飾后泡囊在S180荷瘤小鼠體內(nèi)藥效也有顯著提高。給予較低劑量（1mgkg-1）情況下，Tf-PEG-NS的腫瘤抑制率達(dá)71%，分別為PEG-NS，n-NS和注射劑的1.55, 2.00和2.40倍。療效的提高可以歸結(jié)為以下幾方面原因。首先，PEG-PHDCA的修飾起到了隱形化

36、效果，從而延長(zhǎng)泡囊的血液循環(huán)，有利于通過EPR效應(yīng)富集于腫瘤組織。第二，Tf修飾泡囊將HCPT定向輸送到腫瘤部位。第三，Tf修飾泡囊能有效地增加腫瘤細(xì)胞核內(nèi)藥物量，有利于抗腫瘤藥物療效的發(fā)揮。最后，泡囊的包封能有效地提高藥物的穩(wěn)定性，有利于其活性的保持。所制備的Tf-PEG-NS具有緩釋作用，能增加藥物的核內(nèi)攝取量，增強(qiáng)細(xì)胞毒性，延長(zhǎng)系統(tǒng)循環(huán)時(shí)間，使藥物富集于腫瘤，從而提高藥物的抗腫瘤療效。因此，通過將Tf共價(jià)連接到PEG修飾的泡囊所得的主動(dòng)靶向泡囊是一種較具潛力的抗腫瘤藥物載體。當(dāng)然，載藥系統(tǒng)內(nèi)吞機(jī)制及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑仍需進(jìn)一步研究，其他因素，如膜流動(dòng)性和表面靶頭密度的影響也值得進(jìn)一步探討。RE

37、FERENCES1 Maruyama K, Ishida O, Kasaoka S,et al. Intracellular targeting of sodium mercaptoundecahydrododecaborate (BSH) to solid tumors by transferrin-PEG liposomes, for boron neutron-capture therapy (BNCT). J Control Release 2004;98: 195-207.2 Kursa M, Walker GF, Roessler V,et al. Novel shielded t

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