醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)蛋白質(zhì).

1、2013-7-27第一章 蛋白質(zhì)的分離與純化第一節(jié)蛋勺質(zhì)分富純化的一般原則一、基勺質(zhì)小富純化技術(shù)及其依據(jù)表11主要的蛋白質(zhì)分離純化方法及依據(jù)兀盧性質(zhì)分離方法分/人小與形狀 超濾、透析、密度梯度離心、凝膠過濾層析、凝膠電泳溶解度沉淀法、相分配法.分配層析.結(jié)品、溶劑抽捉、逆流分配電荷分布電泳技術(shù)、等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析、聚焦層析、等電聚倍數(shù)電泳生物功能專-性親和層析疏水性201-7-27疏水作用層析.反相高效液相層析2第一章 蛋白質(zhì)的分離與純化二、蛋勺質(zhì)純化的一般段計原則1 目的蛋勺的分富和純化應(yīng)該盡可能 選擇來源方便、成本低、易操作的組織 或細(xì)胞作為原料；2. 要建立一個特異、快速.可重復(fù).

2、 經(jīng)濟(jì)的目的蛋勺活性檢測方法；3. 蛋勺質(zhì)分離純化工藝的設(shè)計應(yīng)該分 級分禽、丸粗后細(xì)的原則；4. 純化條件要盡可能溫和。2013-7-273第一章 蛋白質(zhì)的分離與純化第二節(jié) 蛋勺質(zhì) 的層析(chromatography) 分禽一、層析技術(shù)的發(fā)畏簡史及科學(xué)意義二、層析技術(shù)的基本原理固定相：在層析糸統(tǒng)分富過程中靜止不 動的相。流動相：在層析糸統(tǒng)分富過程中在我體 上延一定方向移動的相。2013-7-274ReservoirSolution nwbilc pliase I iSolid porous matrix tutioruiry phasl PorouB 8upp<jH2013-7-275

3、煤板理論：（溶質(zhì)在固定相中的濃度） CsK=（溶質(zhì)在流動相中的濃度） Cm把色譜柱比作一個精憎塔，沿用精憎塔中 塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行 為，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率 的指標(biāo)，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、和 等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用 H表不，稱為塔板咼丿艾，簡稱板咼。2013-7-277塔板理論假設(shè)：1 在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分口J以在兩 相間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長稱為 理論塔板高度H。2. 以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不 是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動式，每次進(jìn)氣 為一個塔板體積（） O3. 所有組分開始時存在于第0號塔板上， 而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略。4

4、分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組 分在某一塔板上的量無關(guān)。2013-7-278簡單地認(rèn)為：在毎一塊煤板上，滾質(zhì) 在兩相間很快達(dá)到分配平衡，然后隨 著流動才目按一個一個煤板的方式向前 移動。對于一根長為L的色譜柱，濟(jì) 質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為：n = L/Hn稱為理論塚板教。與精錮煤一樣， 色譜柱的柱效隨理論煤板數(shù)n的增加 而增加，隨板當(dāng)H的增大而減小。2013-7-276464"1十上和轉(zhuǎn)移 11641216"T"40750252013-7-270190 060-2536G75 |2025|2025| 2 25 |675| 675|2727卩01 | 202 | 152

5、I 11 LKJ LKJ20.3103.013S27裳逆A拓W 套E»填去2 口陣«恭 3 鉛IdX董 42013,7,27耳6464 -32 064 -6 一 -】6 _0 032 32 一一和_-廠一二6 一 - 8 一16 32 16 一-LI - " 4 _-二-H-" 一 -一8 24 24 8 fl B B B一 2一 8匚 2Ll00I一 nussF+UsfcO管中溶質(zhì)的總疑層析的展開方式洗脫法也稱沖洗法。工作肘，首丸將 樣品加列色譜柱頭上，然后用吸附或 溶蟹能力比試J樣組分弱得多的氣體或 液體作沖洗利。由于各組分在固定相 上的吸附或溶解能

6、力不同，菠沖洗劑 帶出的丸后次厚也不同，從而使組分 彼此分富。流出曲線下圖。2013-7-27132013-7-27142013-7-27#頂替法是將樣品加到色譜柱頭后，在惰性流動相中加人對定相的吸附或2013-7-27#滋解能力比所有試樣組分強(qiáng)的楊質(zhì)為 頂棒劑或直接用頂棒和作流動相丿, 通過色譜柱，將各組分按吸附或嫁解 能力的強(qiáng)弱順厚，傢次頂棒出固走相。很朗顯，浹附或溶解能力最弱的組分 最丸流出，最強(qiáng)的最后流出。頂替法 的流出曲線如下圖。2013-7-27#2013-7-2716152013-7-27迎頭法是將試樣混合湯決續(xù)通過色譜 柱，吸附或溶蟹能力最弱的組分首先 一純物質(zhì)的狀態(tài)流出，其次

7、則以第一 組分和浹附或涿解能力較弱的第二組 分混合物，以此類推。流出曲線如下 圖OAA+B2013-7-27#層析流出曲線及相關(guān)術(shù)語色譜流出曲線和色譜蜂由檢測彖輸出的電信號強(qiáng)度對 肘間作圖，所得曲線稱為色譜流蟲曲 線。曲線上突起部分就是色譜蜂。如果進(jìn)樣量很小，濃度很低， 在吸附等溫線（宅固吸附色譜丿或分 配等溫線宅液分配色譜丿的線性范 圍內(nèi)，則色譜蜂是對稱的。2013-7-2717基線在實殮襟作條件下，色譜柱后 沒有樣品組分流出時的流出曲線稱為 基線，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直 線。色譜蜂頂點(diǎn)與基線之問的垂直距 離,y人ChJ表示。2013-7-2718進(jìn)樣空氣峰色譜峰色譜流出曲線色譜流沖曲線

8、和色譜峰基線(a)峰高(h)2013-7-27死時間519不閩SI定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時，從進(jìn)樣 到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間，它止比于色譜柱 的空隙體積，如下圖。E樣AA to因為這種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與 流動相流動速度相近。測定流動相平均線速口時，可用柱長 L與t0的比值計算，即u = L/tO2013-7-27202 保留時間tr試樣從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時所經(jīng)過的時間, 稱為保留時間，如下圖。2013-7-27222013-7-27#212013-7-273調(diào)整保留時間某組分的保留時向扣除死時間后，稱為該組分的調(diào)整保留 時間，即 t/= tr-t

9、0ill于組分在色譜柱屮的保留時間包含了組分隨流動相通 過柱子所須的時間和組分在固定相屮滯留所須的時間，所 以實際上是組分在固定相中保留的總時間。保留時間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時 間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留 體積來表示保留值。2013-7-27#4.死體積V"指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空 間、色譜儀屮管路和連接頭間的空間以及檢次'J器的空間的 總和。當(dāng)后兩相很小可忽略不計時，死體積可由死時間與 色譜柱出口的載氣流速巴。（cn?.min"）計算。V（）= t（）F co式中F®為扣除飽和水蒸氣壓并經(jīng)

10、溫度校正的流速。僅適用于氣相色譜，不適用于液相色譜。232013-7-275保留體積V指從進(jìn)樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時所 通過的流動相的體積。保留時間與保留體積關(guān)系：Vr= tr Fco6調(diào)整保留體積Vr，某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整 保留體積。Vr' = vr-vo= t/ Fco2013-7-2724某組分2的麻保留值與組分1的調(diào)整保留值之比，稱 削為相對保留值。r2j= t J / 咕=Vn，/ Vrf由于相對保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱 徑、柱長、填充情況及流動相流速無關(guān)，因此，它在色譜 法屮，特別是在氣相色譜法屮，廣泛用作定性的依據(jù)。2

11、013-7-2725在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標(biāo)弁(S), 然后再求其它峰(i)對這個峰的相對保留值，此時可用 符號a表示，即i(!a = t/(i)/t/ (s)式中t/(i)為后出峰的調(diào)整保留時間，所以oc總是人于1 的。相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標(biāo)，又 稱選擇因子。區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流岀曲線的重要參數(shù)之一， 用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動力學(xué)因素。表示 色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法。1. 標(biāo)準(zhǔn)偏差b即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。2. 半峰寬Wi/2即峰高一半處對應(yīng)的峰寬。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為Wi/2=2.354q3峰底寬度W即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)

12、上的切線在基線上截距間的距離。 它與標(biāo)準(zhǔn)偏差b的關(guān)系是 W = 4c272013-7-27 2013-7-2728從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：(i) 根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù);(ii) 根據(jù)色譜峰的保留值，可以進(jìn)行定性分析；(iii) 根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析；(iv) 色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評價色譜柱分離效能 的依據(jù)；(V)色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(或流動相)選擇 是否合適的依據(jù)。2013-7-2729三、富子交換層析青子交換層析(ion exchange chromatography)牙9用 物質(zhì)的 赴荷與 層析我體(富子交

13、換劑)電荷之間的相 互作用達(dá)到分離純化的目的的星析 方法稱離子交換層析。富子交換利：富子交換星析所用的 固相基質(zhì)，由不滾于水的、具有網(wǎng) 狀結(jié)物的嵩分子聚合腸組成。2013-7-27312013-7-27Polymer IxuiUh with negatively rharciM Aini'tlonal groupsProtcbi mixture is added to culuiiui conlaixiiuK cMinn exdiarrs.Key: nirt. pMitivc diaic.Net positive chATtfv Zt JiRKMiva chr Lxi |；e netd

14、iarvPmteiiiF mevvt through ! h*<column at rate« determinedby thmr nt?i dlarge at thbpli bcuij; Ubcd. Witlj c:aiiuugchagm. proleing withu more negative n(< clittfciikav tastui and dul<? earLur.31w子交換層析的操作1、樣 w的準(zhǔn)備:固體樣品必須6蓉于適當(dāng)富子強(qiáng)度和pH的緩沖液中。組 織液或細(xì)胞裂解液用緩沖液稀釋后 可直接上柱。鹽析樣為必須除鹽后才能進(jìn)行分富O2、爲(wèi)子交換劑的處理

15、：根據(jù)菠分富 樣品的性質(zhì)選擇合適的富子交換劑, 離子交換劑在使用前須先進(jìn)行處理。2013-7-27333、層析柱的準(zhǔn)務(wù)：富子交換層析柱 一般選擇粗短柱為宜，使得樣品在分 富的同肘進(jìn)行濃縮。富子交換劑的用 量根據(jù)樣品量和交換劑的交換彖量確 定 O4、樣昌分富：上樣量的多少與目的 蛋自的性質(zhì)、濃度及交換劑的親和力 有關(guān)。在分靂過程中，應(yīng)注意A2013-7-271J樣為的濃度不宜過大332J滾解蛋勺質(zhì)樣品的緩沖液的富子強(qiáng)度要低于起始緩沖液3丿上樣速度不要過快4丿上樣緩沖液的pH應(yīng)合適5、洗脫2013-7-27346、洗脫液的鑒定和回收7、富子交換劑的再生與儲存州 |<I n 1-eiH州 |&

16、lt;I n 1-eiH2013-7-2735州 |<I n 1-eiH天掄粉各成分 用特種雷子交 換劑層析分富392013-7-27392013-7-27402013-7-2742二、分子篩原理2013-7-27#2013-7-27#2013-7-27#2013-7-27#凝膠層析原理圖2013-7-27#2013-7-27#SihmII molrciilrIjargc moire tileEludon columnImkU=.x=-=r.ns乙三 2OJdVolume (mt.)2013-7-2743加樣兒斤始洗脫IIIII432013-7-27凝膠過濾的分配糸數(shù)(Ve-VO)(Vi

17、)2013-7-2745主要凝膠過濾介質(zhì)的牌號及骨架結(jié)構(gòu)«號件架類型生產(chǎn)飆位備注Sephadex.KmeTHham Pharmacia< 瑙典衍生產(chǎn)品Sephadex HLSephasorb HP系列產(chǎn)品Sepharcwc CLSepharoseAmershani lharmaciaSepharose FFSu peruseBio Gel A瓊脂*litoRad （ 國Superdex瓊脂梢爸聚期Anwrham Pharm-ariaBio-Gel P聚丙烯航胺Bto-RadSeplucryl««« «丙饒醴Amersham Pharmac

18、ia改進(jìn)產(chǎn)品Sephacryl HRSephacryl SFEupergit C聚丙墀般鞍系德國件架內(nèi)含有環(huán)代松Toyopearl聚乙X傅系TosoHahs （ H 本）Bio-BeadsS-X聚萃乙烯系Bio Rad2013-7-2745葡聚糖凝膠（G）型號分離范圍（分子量）吸水量 （克/克 干凝膠）膨脹體積（亳升/ 克干凝膠）浸泡時間蛋白質(zhì)多糖2025 c90 100 c10<700<7001.02-33115<1500<15001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-8000001000-2000002030-40725親和層析：利用生揚(yáng)分子間特殊的親 和關(guān)糸進(jìn)行的分富方凍。是蛋勺質(zhì)分 W純化的最有放的方弘之一，有肘甚 至可以僅用一步