凝膠遷移或電泳遷移率試驗(yàn)EMSA

1、1）什么是凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)？凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA 是一種研究 DNA 結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA 結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA 結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA 結(jié)合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P 同位素標(biāo)記的 DNA 或 RNA 探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或 RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類 的 DNA 結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或

2、核細(xì)胞抽提液。在檢測(cè)RNA 結(jié)合蛋白時(shí)，依據(jù)目的 RNA 結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競(jìng)爭(zhēng)實(shí) 驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA 或 RNA 片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來(lái)確定 DNA 或 RNA 結(jié)合蛋白的特異性。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的 特點(diǎn)和強(qiáng)度來(lái)確定特異結(jié)合。2）作這樣的實(shí)驗(yàn)需要什么試劑？凝膠遷移實(shí)驗(yàn)需要的結(jié)合蛋白，可來(lái)源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必須制備同位素標(biāo)記的 DNA 或 RNA 一般，DNA 核苷酸探針用 g-32P 和 T4 多核苷酸激酶來(lái)作末端標(biāo) 記，同位素標(biāo)記的

3、RNA 用噬菌體 RNA 聚合酶和同位素標(biāo)記的核苷酸在體外合成。Promega 公司的Riboprobe?/sup 系統(tǒng)（a,b）（目錄號(hào) P1420，P1430， P1440， P1450， P1460）可用于同位素標(biāo)記 的 RNA 的體外合成，DNA5末端標(biāo)記系統(tǒng)（目錄號(hào) U2010）用于制備 DNA 探針，結(jié)合反應(yīng)所需的組 分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（Tris-HCl 或 HEPES、還原劑（DTT、 甘油、非特異的競(jìng)爭(zhēng) DNA（poly（dl:dC）?dl:dC），也可能含非離子去污劑。在結(jié)合蛋白和同位素標(biāo)記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合

4、物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影， 或用Phosphorlmage?/sup 分析。3）凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)提供了什么試劑？Promega 公司提供一種凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)DNA 結(jié)合蛋白，系統(tǒng)可作為這類實(shí)驗(yàn)的一種正對(duì)照。系統(tǒng)包括目的寡核苷酸，對(duì)照DNA 結(jié)合蛋白，結(jié)合緩沖液，用于寡核苷酸探針末端標(biāo)記所需的試劑。Core 系統(tǒng)（目錄號(hào) E3050）包括含重組 AP2 蛋白（AP2 抽提液）的大腸桿菌抽提液和AP2 的同源寡核苷酸。AP2 抽提液是從表達(dá) AP2 蛋白的大腸桿菌中提取的。另外， Core 系統(tǒng)還含 SP1 同源寡 核苷酸，凝膠遷移結(jié)合緩沖液（5），和能作 20 次對(duì)照實(shí)驗(yàn)的 HeLa

5、核抽提液。Complete 系統(tǒng)（目 錄號(hào) E3300）含另外 5 個(gè)雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1 CREB,、NF-kB、TFIID 結(jié)合位點(diǎn)的同源序列。這些寡核苷酸可以在末端標(biāo)記后用作特異性探針，或在競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中用作非特異性探針。參考凝膠遷移實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)TB110 獲取更多的資料。4）成功進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化哪些因素？凝膠遷移實(shí)驗(yàn)在理論上很簡(jiǎn)單也很快速，但要成功地進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化一些參數(shù)，這 主要受結(jié)合蛋白的來(lái)源和探針結(jié)合位點(diǎn)特點(diǎn)的影響。以下是需要優(yōu)化的因素：抽提液的制備（核 酸酶和磷酸酶污染會(huì)使探針降解） ，結(jié)合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配

6、方和 pH,聚丙烯凝膠電泳的特點(diǎn)和電泳條件，保溫時(shí)間和溫度，載體蛋白，是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素）?？傊?，反應(yīng)總體積應(yīng)最小（ 20ul、。為滿足一般要求，結(jié)合緩 沖液含 4%甘油，1mMMgCl2, 0.5mMEDTA, 0.5mMDTT, 50mMNaCl, 10mMTris-HCl（pH7.5）, 0.05mg/ml poly（dl:dC）?dl:dC, 或 10mMHEPES（pH7.9）, 50mMKCl, 1mMDTT, 1mMEDTA, 10% 甘油， 0.05mg/ml poly（dI:dC）?dI:dC可作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的起始。參考凝膠遷移實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)TB110

7、 獲取更多的資料。5）提供了哪些同源的多核苷酸引物，這些引物的序列來(lái)源是什么？有各類 dsDNA 探針，它們含各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的同源結(jié)合位點(diǎn)。下表列岀了所能提供的探針，和 這些引物序列的岀處。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子探針 探針名 目錄號(hào) 序列（上鏈） 序列的出處Sp1 E3231,E3232 5-ATT CGA TC G GGG CGG （GC GCG-3 SV40 啟動(dòng)子（1）API E3201 E3202 5-CGC T TG ATG AGT CAG CCGGAA-3 膠原酶基因 TRE（ 2）AP2 E3211 E3212 5-GAT C GA ACT GAC CGC CCG CGG CCC Gh

8、人金屬硫堇 Ila（3）基因 NF-kB E3291, E3292, 5-AGT T GA GGG GAC TTT CC AGG C-3 鼠 Igk 輕鏈基因（4）Octi E3241 E3242 5-TGT CG A ATG CAA ATC ACT AGA A-3 Ig 重鏈基因（5）CREB E3281 E3282 5-AGA GA T TGC CTG ACG TCA GAC AG） TAG-3 大鼠生長(zhǎng)激素抑制基因（6）TFIID E3221 E3222 5- GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG ABbelta-1 球蛋白啟動(dòng)子 只列出了上鏈的序列，探針是雙鏈

9、，下鏈序列和上鏈序列配對(duì)。黑體字表明序列來(lái)源于指定的基 因序列，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的序列用下線表明。一般而言，周圍的核苷酸是任意。6）在 DNA 探針的選擇上，要考慮哪些重要因素？目的 DNA 的長(zhǎng)度應(yīng)小于 300bp，以有利于非結(jié)合探針和蛋白DNA 復(fù)合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應(yīng)用短的寡 核苷酸片段（約為 25bp） ,這樣結(jié)合位點(diǎn)可和其他因子的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)別開。 長(zhǎng)的限制性酶切片段可 用于對(duì)推定的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)定位。隨后可用DNaseI 印跡對(duì)蛋白結(jié)合的特異區(qū)域在 DNA 序列水平上作岀分析。7）用

10、以下一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和 HeLa 細(xì)胞核抽提物可形成哪些復(fù)合物：API, AP2, CREB, NFkB,Octi, Sp1, TFIID, TFIIB 。當(dāng)用 HeLa 細(xì)胞核抽提物作為結(jié)合蛋白的來(lái)源時(shí)，每1 個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和它相關(guān)的DNA 同源序列結(jié)合形成特征型的結(jié)合形態(tài)。以下的文字描述了每一個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括識(shí)別的同源序列，因子的大小，特定的結(jié)合條件，以及和HeLa 細(xì)胞核抽提物可形成的復(fù)合物的數(shù)目。1.API: AP1 （激活蛋白 1）是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它結(jié)合的同源序列為5-TGAGTCA-3。當(dāng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在 AP1 的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，這些基因可以被誘導(dǎo)，比如用佛波酯可誘

11、導(dǎo)蛋白激酶（2,7）。在細(xì)胞中，AP1 形成 c-Jun 或 Jun 相關(guān)蛋白的同聚雙體，或者形成c-Jun 或 Jun 相關(guān)蛋白和 c-Fos或 Fos 相關(guān)抗原（Fras ）的異源雙體。Fos 蛋白自身不能形成同聚雙體，并不能單獨(dú)和AP1 結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。c-Jun 蛋白是一個(gè) 40kDa 的單體蛋白并通過(guò)亮氨酸拉鏈形成同聚雙體。在HeLa 細(xì)胞中，AP1 的主要形式是 c-Jun 蛋白的同聚雙體。在凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中，形成一個(gè)特異的復(fù)合物。當(dāng)作凝膠 遷移實(shí)驗(yàn)測(cè)定 AP1 的活力時(shí)，除了基本的溶液組分外，應(yīng)將 0.01mg/ml poly（dl:dC）?dl:dC）,100ugBSA, 5mMD

12、T 功廿入到結(jié)合緩沖液中。如用純化的蛋白，則用1-2ug 的蛋白來(lái)檢測(cè)遷移復(fù)合物。2.AP2: AP2 是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可分別作為TPA-和cAMP誘導(dǎo)因子（10）。它是一個(gè) 52 kDa 的蛋白，識(shí)別的同源序列為5-CCCCAGGC-3 或 5-GCCNNGGC-3（ 3）。這個(gè)因子對(duì)視黃酸特別敏感，可能在形態(tài)發(fā)生中起著重要作用。HeLa 細(xì)胞核抽提物和 AP2 同源 DNA 探針形成一個(gè)特定的復(fù)合物。用純化的蛋白作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)用20-50ng 的蛋白。3.CREB CREB 是個(gè) 37kDa 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對(duì) cAMP 應(yīng)答，識(shí)別 5-T （ G/T） ACGTCA-3DNA

13、同 源序列（6 ,11）。它含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)而形成同聚雙體，相關(guān)的基本結(jié)構(gòu)域和c-JunDNA 結(jié)合結(jié)構(gòu) 域同源。當(dāng)用 HeLa 細(xì)胞核抽提物時(shí)，能和 CREB 同源序列形成一個(gè)復(fù)合物。4.NF-kB: NF-kB 最初被鑒定為在 B 細(xì)胞中和免疫球蛋白 k 輕鏈的增強(qiáng)子結(jié)合。 但隨后在非 B-細(xì) 胞的細(xì)胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)， 形成 NF-kB 和 I kB 的復(fù)合物。 最初在 DNA結(jié)合蛋白復(fù)合物中分離的 NF-kB 是由 p65（RelA）和 p50 構(gòu)成的異源雙聚體。其他分離的單體包括 p49 （也可稱為p52 ），p75（c-Rel ） ,p68（RelB）。p65，p68，p75 單體起反式

14、激活作用。p50，p49 （ p52）單體具有 DNA 結(jié)合活力，但只具有微量的反式激活作用。據(jù)報(bào)道 p49 和 NF-kB 的單體 p65 形成具有轉(zhuǎn)錄活力的異源雙體，類似于 p50/ p65 異源雙體。p49/ p65 和 p50/ p65 異源雙體在細(xì)胞質(zhì)中受一種叫IkBa/MAD-3的抑制劑調(diào)節(jié)。IkB 和 p65 單體結(jié)合，阻制了細(xì)胞核中的定位和DNA 的結(jié)合。在體外高濃度的p65能形成同源雙聚體，能和DNA 微弱地結(jié)合。Poly(dl:dC) 能抑制這一反應(yīng)(14)。p49 和 p50 也能形成同源雙聚體，但在細(xì)胞中的濃度很低。通常，在作NF-kB 的凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，在 20ul

15、的反應(yīng)體積中，有溶于 10 mMHEPES 勺 0.28pmoles 的 NF-kB9 寡核苷酸(pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA,2.5mM DTT, 10%甘油，0.05%NP-40。當(dāng)用純化的蛋白時(shí)，250-300ng 足以形成凝膠遷移復(fù)合物，而需用10ug 的 HeLa 細(xì)胞核抽提物。 凝膠遷移復(fù)合物在室溫中保溫30 分鐘，在 50mMTris(pH8.3)和 38mM 甘氨酸的 7%聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離凝膠遷移復(fù)合物。含考馬斯蘭和二甲苯藍(lán)色素的加樣溶液只 能加入到陰性對(duì)照反應(yīng)中，因這兩種色素會(huì)加劇NF-kB 復(fù)合物的解離。當(dāng)用 HeLa 細(xì)胞核抽提物作為結(jié)合蛋

16、白來(lái)源時(shí)，可形成兩種序列特異的凝膠遷移復(fù)合物，即p50/p50 同源雙聚體和 p50/ p65異源雙聚體。在表達(dá) p49，p50，p65 的細(xì)胞中，可檢測(cè)到 4 個(gè)序列特異的凝膠遷移復(fù)合物(p49/ p49，p50/ p50 ，p50/ p65 ，p49/ p65 )，如果存在高濃度的p65，可檢測(cè)到微量的p65/p65。下列試劑可加強(qiáng) NF-kB 在體外的結(jié)合：mM 的 GTP ATP,精胺，亞精胺，鋇或鈣離子，ng 的 Co+3(NH3)6 (12)5. OCT1 OCT 是 OCT 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家簇中的一員，顯然在哺乳細(xì)胞中存在比較廣泛(5)。POU 結(jié)構(gòu)域包括 POU-box 和 Ho

17、meo 結(jié)構(gòu)域。當(dāng)用 HeLa 細(xì)胞核抽提物時(shí)，可檢測(cè)到一個(gè)與OCT1 同源探針形成的序列同源凝膠遷移復(fù)合物。6.SP1:SP1 是一個(gè) O-糖基化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它識(shí)別 10 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的同源序列5-GGGGCGGGGC-3(1)。核心識(shí)別序列是 5-GGGGCGGG-&同核心序列相似的序列常存在于啟動(dòng)子中。SV40 的早期啟動(dòng)子就是一個(gè)例子，它是第一個(gè)可以結(jié)合SP1 的啟動(dòng)子。根據(jù)糖基化的不同，它的分子量在95-105kDa，DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的三個(gè)鋅指紋決定了序列的特異性。HeLa 細(xì)胞核抽提物與 SP 侗源探針形成特異的凝膠遷移復(fù)合物。7. TFIID/TFIIB : TF

18、IID 和 TFIIB 是基本的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與RNA 聚合酶 II 啟動(dòng)子的基本的轉(zhuǎn)錄(16)。TFIID 與真核啟動(dòng)子的 TATA 區(qū)域形成特異的 DNA 結(jié)合。TFIID 由幾個(gè)蛋白組成，而其中 的 TATA 區(qū)域結(jié)合蛋白(TBP)，參與 TATA 序列的結(jié)合。TFIID 的其他的蛋白組分被稱為TBP-相關(guān)因子(TAFs)o用 TFIID 探針寡核苷酸和 HeLa 細(xì)胞核抽提物，可得到一個(gè)微弱的凝膠遷移帶，但 很難確定為是 TFIID 序列特異凝膠遷移復(fù)合物。純化的重組的TBP 很難作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，這部分是由于 TBP 存在很強(qiáng)的正電荷，導(dǎo)致TBP/DNA 復(fù)合物很難進(jìn)入凝膠。純化的T

19、BP 形成二聚體后不能結(jié)合 DNA( 17)o因此形成的二聚體可參與DNA 結(jié)合。TFIIB 不單獨(dú)與 DNA 結(jié)合，但與 TFIID 結(jié)合后增強(qiáng)它與 DNA 的結(jié)合。TFIIB 與預(yù)啟動(dòng)復(fù)合物結(jié)合后，致使RNA 聚合酶 II 和 TFIIF 結(jié)合到轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)。故TFIIB 在預(yù)啟動(dòng)復(fù)合物的形成中有重要作用。當(dāng)用純化的 TFIID 作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，poly(dI-dC)不用加入結(jié)合反應(yīng)中。結(jié)合緩沖液含 10%甘油，20mMTris(pH8.0), 10mMMgCl2, 2mMDTT, 89mMKCl 。對(duì) TFIID 的 凝膠結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，可加入 poly (dG:dC) ?dG:dC。形成的

20、復(fù)合物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中 分離，凝膠組分是：0.5 TBE, 6%聚丙烯酰胺凝膠(19:1 丙烯酰胺：雙叉),4mMMgCl2, 0.02%NP-40, 電泳緩沖液組分是：0.5 TBE 4mMMgCl2,0.02%NP-40。當(dāng)研究含 TFIID 和 TFIIB 的復(fù)合物時(shí)，應(yīng)從結(jié)合緩沖液，凝膠，和電泳緩沖液中去除MgCl2。這些是一般的要求，用不同的細(xì)胞抽提物和 TFIID、TFIIB 形成復(fù)合物作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)對(duì)多種因素進(jìn)行優(yōu)化以達(dá)到理想的條件。8) 在一次凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中，用多少量的蛋白質(zhì)或抽提物，和標(biāo)記的DNA 探針？對(duì)每一個(gè)特定的結(jié)合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化

21、蛋白，粗制核抽提液需作優(yōu)化，一般所用純化蛋白的量在 20-2000ng 間，可將蛋白：DNA 的等摩爾比調(diào)整為蛋白的摩爾數(shù)是DNA 的 5倍。用粗制核抽提液，需要 1-20ug 蛋白形成特異的復(fù)合物。所加入反應(yīng)的探針的量是 50, 000-200，000cpm32P-標(biāo)記的探針(高特異活性)，反應(yīng)體積為 1-5ulo這相當(dāng)于 10-50fmoles 的 DNA 探針。 探針應(yīng)保存在-20oC以防止降解，在合成或標(biāo)記后1-2 個(gè)星期內(nèi)必需使用。無(wú)論探針或是結(jié)合蛋白應(yīng)避免多次凍融。9) 能用體外翻譯法制備目的蛋白質(zhì)嗎？Promega 沒(méi)對(duì)所有的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子作這類測(cè)試。一般，用麥胚抽提物作哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)

22、錄因子或DNA結(jié)合蛋白的體外翻譯，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶裂解液可能含有內(nèi)源哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子或DNA 結(jié)合蛋白。但 TNT？ /sup兔網(wǎng)織細(xì)胞溶解液系統(tǒng)（a,b,c,d ）與 TranscendTM 生物素標(biāo)記的 tRNA（目錄號(hào)E3201） 同使用，翻譯了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AP1（ c-Jun），它使 AP1 同源寡核苷酸（目錄號(hào) E3201 ）產(chǎn)生的遷移效果和重組的AP1 相同（18）。TNT？ /supT7 偶聯(lián)的麥胚抽提物（b,c,d,e ）在體外翻譯了 c-Rel。這一蛋白特異地使免疫球蛋白k 輕鏈增強(qiáng)子探針產(chǎn)生遷移。在c-Rel 結(jié)合反應(yīng)中加入體外翻譯的 MAD-3（ IkB 家簇中一員）可干擾

23、其相互作用。10）poly（dl:dC）?dl:dC），非特異性競(jìng)爭(zhēng) DNA 特異性競(jìng)爭(zhēng) DNA 的功能是什么？它由肌苷和胞嘧啶組成。由于其特定的結(jié)構(gòu)，可抑制蛋白對(duì)標(biāo)記探針的非特異結(jié)合，避免假?gòu)?fù)合物。 在凝膠遷移反應(yīng)中加入poly（dl:dC）?dl:dC），可抑制粗制核抽提液中其它DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合，比如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的非特異結(jié)合。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時(shí)，不必一定加入poly（dl:dC）?dl:dC） ，如加入，則普通反應(yīng)中所用終濃度不超過(guò)50-100ng。對(duì)核抽提液，每 2-3ug核抽提液用 1 ug poly（dI:dC）?dI:dC）。為確定所形成的復(fù)合物的特異性，在含或不含

24、增量的非放射性的特異競(jìng)爭(zhēng) DNA 或非特異的競(jìng)爭(zhēng) DNA 時(shí)，作結(jié)合反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。一般，非放射性的特異 DNA 是非標(biāo)記的 DNA探針，非特異的競(jìng)爭(zhēng)DNA，長(zhǎng)度組成和 DNA 探針相同，序列不同。用非放射性的特異 DNA 能競(jìng)爭(zhēng)掉，而用非特異的競(jìng)爭(zhēng)DNA 不能競(jìng)爭(zhēng)掉的復(fù)合物，表明目的蛋白和同位素標(biāo)記探針的特異 結(jié)合。非 特異 結(jié)合 能用特異 DNA 和非 特異 的競(jìng)爭(zhēng) DNA 競(jìng)爭(zhēng)掉。結(jié) 合溶 液中的 poly（dI:dC）?dI:dC） 的量需作優(yōu)化，但一般用 0.05mg/ml。非放射性的（特異或非特異）的競(jìng)爭(zhēng) DNA 的用量也需優(yōu)化或滴定，但競(jìng)爭(zhēng) DNA 通常是同位素標(biāo)記的探針的10-

25、1000 倍（w/w）。其他類型的競(jìng)爭(zhēng) DNA 如小牛胸腺 DNA 不能用于凝膠遷移反應(yīng)，它們會(huì)帶有目的蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。11）用什么凝膠條件將蛋白質(zhì)/探針復(fù)合物和游離的探針?lè)蛛x開？將結(jié)合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結(jié)合，蛋白/探針復(fù)合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%（ 30： 1 丙烯酰胺：雙叉），在特定條件下可用高或低的濃度。PH,聚丙烯酰胺的濃度，丙烯酰胺：雙叉丙烯酰胺的比會(huì)影響復(fù)合物在凝膠中的遷 移。大多數(shù)蛋白用 10-15伏的電壓，解離快的蛋白用短時(shí)間和高的電壓（30-35 伏的電壓），電泳時(shí)所用的 TBE 和 TAE 必需是新配制的，無(wú)沉淀

26、。低的離子強(qiáng)度和丙烯酰胺基質(zhì)的 箱子效果 有助于復(fù)合物的穩(wěn)定。也可將TGE 緩沖液（12.5mMTris,pH8.3, 95mM 甘氨酸，0.5mMEDTA 用于不穩(wěn)定的蛋白/DNA 復(fù)合物?？稍?4oC 進(jìn)行結(jié)合和電泳實(shí)驗(yàn)以阻止不穩(wěn)定復(fù)合物和探針的解離。加樣樣品 液中的色素會(huì)導(dǎo)致不穩(wěn)定復(fù)合物的解離，應(yīng)用不含考馬斯蘭和二甲苯藍(lán)的加樣樣品液。當(dāng)帶型不 緊密岀現(xiàn)拖尾時(shí)，表明復(fù)合物存在解離。凝膠必需完全聚合，以避免帶型拖尾。如復(fù)合物不進(jìn)入 凝膠則表明所用的蛋白或探針過(guò)量，或鹽的濃度過(guò)量不適用于這一反應(yīng)。在含抽提液的帶中不含 游離探針或復(fù)合物，但只含探針的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，應(yīng)在抽

27、提液中和 結(jié)合反應(yīng)中加入相應(yīng)的抑制劑。目前可用高強(qiáng)度瓊脂糖凝膠分離蛋白/探針復(fù)合物（Metaphor?/sup/agarose ）。12） 如何在一個(gè)特定的復(fù)合物中確定一個(gè)蛋白質(zhì)的存在？部分純化的蛋白或粗制核抽提液和一個(gè)特定的探針可形成一個(gè)或幾個(gè)特異的蛋白復(fù)合物。 多個(gè)復(fù) 合物的存在表明蛋白降解，應(yīng)在制備抽提液的溶液中和結(jié)合反應(yīng)中加入蛋白酶抑制劑。確定復(fù)合 物中蛋白的特征可能會(huì)困難，但有一些方法作這方面的研究。如有目的蛋白的抗體，可進(jìn)行超遷 移實(shí)驗(yàn)，抗體和蛋白/探針復(fù)合物中的蛋白結(jié)合，使復(fù)合物的遷移延遲，形成超遷移。增量的抗體 加入到結(jié)合反應(yīng)中。抗體可加入到蛋白和探針?lè)磻?yīng)后，也可將抽提物與抗體

28、結(jié)合后，再加入探針。 取決于抗體的特定的抗原決定簇，前者有利于超遷移復(fù)合物地形成，后者阻止復(fù)合物的形成導(dǎo)致 原復(fù)合物的強(qiáng)度的減少。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)對(duì)抗體作滴定，先使抗體：蛋白的摩爾比為1: 1，然后應(yīng)需要增加抗體的量。當(dāng)有純化的蛋白時(shí)，可用它們和實(shí)驗(yàn)的帶型遷移復(fù)合物比較。除超遷 移實(shí)驗(yàn)外，復(fù)合物中蛋白的特征也可用UV 交聯(lián)和標(biāo)記轉(zhuǎn)移來(lái)分析。在均質(zhì)標(biāo)記的探針和細(xì)胞核抽提物保溫后，用 UV 照射使復(fù)合物交聯(lián)，隨后用DNA 酶降解未保護(hù)的探針。需用均質(zhì)標(biāo)記的探針，因 DNA 酶會(huì)從末端標(biāo)記的探針中除去標(biāo)記。和保護(hù)的幾個(gè)核苷酸交聯(lián)的蛋白在變性聚丙烯酰胺凝 膠中經(jīng)電泳分離，干燥，放射自顯影。結(jié)合蛋白的

29、分子量可和標(biāo)準(zhǔn)分子參照物比較。也可用目的 蛋白的抗體對(duì)復(fù)合物作 Western 印跡分析(20)。 如一個(gè)蛋白和 DNA 探針的特定序列結(jié)合，可用含保守結(jié)合序列的競(jìng)爭(zhēng)寡核苷酸，以及突變體來(lái)確定它的特征。也可用定點(diǎn)突變將保守序列結(jié)合位 點(diǎn)改變來(lái)研究復(fù)合物的形成。參考資料1. Briggs M R et al 1986 Scie nee 234, 472. Lee W et al 1986 Cell 49, 7413. Williams T et al 1989 Genes Dev 2, 15574. Sen R and Baltimore D 1986 Cell 46, 7055. Parlso

30、w T G et al 1984 Proc Natl Acad Sei USA 81,26506. Mon tmi ny M R et al 1986 Proc Natl Acad Sei USA 83, 66827. An gel P et al 1987 Cell 49, 7298. Chiu R et al 1988 Cell 54, 5419. Rauscher F J et al 1988 Cell 52,47110. Imagawa M et al 1987 Cell 51, 25111. Berkowitz L A and Gilman M Z 1990 Proc Natl Ac

31、ad Sci USA 87, 525812. Baeuerle P A 1991 Biochim Biophys Acta 1071, 6313. Duckett C S et al 1993 Mol Cell Biol 13, 131514. Urban M B et al 1991 EMBO J 10(7), 181715. Dynan W S and Tjian R 1983 Cell 35, 7916. Peterson M G et al 1990 Scie nee 248, 165217. Colema n R A et al 1995 J Biol Chem 270, 13842

32、18. Beckler G and Hurst R 1993 Promega Notes 43,2419. DiD on ato, J A and Karin M 1993 Promega Notes 42, 1820. Demczuk S et al 1993 Proc Natl Acad Sci USA90,2574使用了 Promega 公司凝膠遷移實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品的參考資料1Xu J and Clark RAF 1997 J Cell Biol 136, 473 (SP12 Dbaibo G S et al 1997 J Exp Med 185, 4813 Pan Z K et al 1996

33、 J Clin In vest 98, 20424 Kochekova M et al 1997 J Clin In vest 99, 30005 Avan taggiati M L et al 1997 Cell 89, 11756 Schmedite, J F et al 1997 J Biol Chem 272, 6017 Lee B S et al 1997 J Biol Chem 272, 1748 Ohlss on B G et al 1997 J Clin In vest 98, 78和 NFkB 保守序列寡核苷酸）（NFkB 保守序列寡核苷酸）（NFkB 保守序列寡核苷酸）（S

34、P1 保守序列寡核苷酸）（AP1 保守序列寡核苷酸）（NFkB 保守序列寡核苷酸）（AP2 和 SP1 保守序列寡核苷酸和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）（AP1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）植物基因工程表達(dá)載體的改進(jìn)和優(yōu)化策略植物基因工程表達(dá)載體的改進(jìn)和優(yōu)化策略將特定的外源基因構(gòu)建在植物表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)入受體植物，并不是植物遺傳轉(zhuǎn)化的最終目的。理想的轉(zhuǎn)基因植物往往需要外源基因在特定部位和特定時(shí)間內(nèi)高水平表達(dá)， 產(chǎn)生人們期望的表型性狀。然而，近二十年的發(fā)展歷史卻表明，外源基因在受體植物 內(nèi)往往會(huì)出現(xiàn)表達(dá)效率低、表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定甚至基因失活或沉默等不良現(xiàn)象，導(dǎo)致轉(zhuǎn) 基因植物無(wú)法投入實(shí)際應(yīng)用。另外，轉(zhuǎn)基因植物的安全性問(wèn)題已在許多國(guó)家

35、引起人們 的關(guān)注，例如，轉(zhuǎn)基因有可能隨花粉擴(kuò)散，抗生素篩選標(biāo)記基因有可能使臨床上的某 些抗生素失去作用等等。以上問(wèn)題的出現(xiàn)使得植物基因工程這一高新技術(shù)正處于一種前所未有的困擾時(shí)期。針對(duì)這些問(wèn)題，近幾年人們對(duì)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行了多方面的 探索和改進(jìn)，植物表達(dá)載體的改進(jìn)和優(yōu)化就是其中最重要的一項(xiàng)內(nèi)容，本文就已經(jīng)取 得的進(jìn)展進(jìn)行綜述。1啟動(dòng)子的選用和改造外源基因表達(dá)量不足往往是得不到理想的轉(zhuǎn)基因植物的重要原因。由于啟動(dòng)子在決定基因表達(dá)方面起關(guān)鍵作用，因此，選擇合適的植物啟動(dòng)子和改進(jìn)其活性是增強(qiáng)外 源基因表達(dá)首先要考慮的問(wèn)題。目前在植物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，例如，絕大多數(shù)雙子葉轉(zhuǎn)基

36、因植物均使用CaMV35S啟動(dòng)子，單子葉轉(zhuǎn)基因植物主要使用來(lái)自玉米的Ubiquitin啟動(dòng)子和來(lái)自水稻的Actinl啟動(dòng)子。在這些組成型表達(dá)啟動(dòng)子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)。然而，外源基因在受體 植物內(nèi)持續(xù)、高效的表達(dá)不但造成浪費(fèi)，往往還會(huì)引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植 物的生長(zhǎng)發(fā)育。為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，同時(shí)又可減少對(duì)植物的不 利影響，目前人們對(duì)特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用越來(lái)越重視。已發(fā)現(xiàn)的特異性啟動(dòng) 子主要包括器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子。例如，種子特異性啟動(dòng)子、果實(shí) 特異性啟動(dòng)子、葉肉細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、根特異性啟動(dòng)子、損傷誘導(dǎo)特

37、異性啟動(dòng)子、 化學(xué)誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、熱激誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子等。這些特異 性啟動(dòng)子的克隆和應(yīng)用為在植物中特異性地表達(dá)外源基因奠定了基礎(chǔ)。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)基因煙草中Bt毒蛋白基因的表達(dá)，由于 該啟動(dòng)子可受水楊酸及其衍生物誘導(dǎo)，通過(guò)噴酒廉價(jià)、無(wú)公害的化學(xué)物質(zhì)，誘導(dǎo)抗蟲 基因在蟲害重發(fā)生季節(jié)表達(dá)，顯然是一個(gè)十分有效的途徑。在植物轉(zhuǎn)基因研究中， 使用天然的啟動(dòng)子往往不能取得令人滿意的結(jié)果， 尤其是 在進(jìn)行特異表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，表達(dá)水平大多不夠理想。對(duì)現(xiàn)有啟動(dòng)子進(jìn)行改造，構(gòu) 建復(fù)合式啟動(dòng)子將是十分重要的途徑。例如，Ni等人將章魚堿合成酶基因啟動(dòng)

38、子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)與甘露堿合成酶基因啟動(dòng)子構(gòu)成了復(fù)合啟動(dòng)子，GUS 表達(dá)結(jié)果表示：改造后的啟動(dòng)子活性比35S啟動(dòng)子明顯提高。吳瑞等人將操作誘導(dǎo)型的PI-II基因啟動(dòng)子與水稻Actinl基因內(nèi)含子1進(jìn)行組合，新型啟動(dòng)子的表達(dá)活性提高了近10倍（專利）。在 植物基因工程研究中，這些人工組建的啟動(dòng)子發(fā)揮了重要作用。2增強(qiáng)翻譯效率為了增強(qiáng)外源基因的翻譯效率，構(gòu)建載體時(shí)一般要對(duì)基因進(jìn)行修飾，主要考慮三 方面內(nèi)容：2.1添加5-3-非翻譯序列許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，真核基因的5-3-非翻譯序列（UTR）對(duì)基因的正常表達(dá)是非常必要的，該區(qū)段的缺失常會(huì)導(dǎo)致mRNA的穩(wěn)定性和翻譯水平顯著下降。例如，在煙草花葉病毒（TMV

39、）的126kDa蛋白基因翻譯起始位點(diǎn)上游，有一個(gè)由68bp核苷酸組成的Q元件，這一元件為核糖體提供了新的結(jié)合位點(diǎn)，能使Gus 基因的翻譯活性提高數(shù)十倍。目前已有許多載體中外源基因的5-端添加了Q翻譯增強(qiáng)序列。Ingelbrecht等曾對(duì)多種基因的3-端序列進(jìn)行過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)章魚堿合成酶基因的3-端序列能使NPTII基因的瞬間表達(dá)提高20倍以上。另外，不同基因的3-端序列增進(jìn)基因表達(dá)的效率有所不同，例如，rbcS3-端序列對(duì)基因表達(dá)的促進(jìn)作用比查爾酮合酶基因的3-端序列高60倍。2.2優(yōu)化起始密碼周邊序列雖然起始密碼子在生物界是通用的，然而，從不同生物來(lái)源的基因各有其特殊的起始密碼周邊序列。例如，

40、植物起始密碼子周邊序列的典型特征是AACCAUGC,動(dòng)物起始密碼子周邊序列為CACCAUG，原核生物的則與二者差別較大。Kozak詳細(xì)研究過(guò)起始密碼子ATG周邊堿基定點(diǎn)突變后對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯所造成的影響，并總結(jié)出在真核生物中，起始密碼子周邊序列為ACCATGG時(shí)轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高，特別是-3位的A對(duì)翻譯效率非常重要。該序列被后人稱為Kozak序列，并被應(yīng)用于表達(dá)載體的構(gòu)建中。例如，有一個(gè)細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶基因，原來(lái)的起始密碼周邊序列為UUUAUGG，當(dāng)被修飾為ACCAUGG，其在煙草中的表達(dá)水平提高了8倍。因此，利用非植物來(lái)源的基因構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)根據(jù)植物起始密碼子周邊序列的特征加以修飾改造。2.3

41、對(duì)基因編碼區(qū)加以改造如果外源基因是來(lái)自于原核生物，由于表達(dá)機(jī)制的差異，這些基因在植物體內(nèi)往 往表達(dá)水平很低，例如，來(lái)自于蘇云金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表 達(dá)量非常低，研究發(fā)現(xiàn)這是由于原核基因與植物基因的差異造成了mRNA穩(wěn)定性下降。美國(guó)Monsanto公司Perlak等人在不改變毒蛋白氨基酸序列的前提下，對(duì)殺蟲蛋 白基因進(jìn)行了改造，選用植物偏愛(ài)的密碼子，增加了GC含量，去除原序列下影響mRNA穩(wěn)定的元件，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因植株中毒蛋白的表達(dá)量增加了30100倍，獲得了明顯的抗蟲效果。3消除位置效應(yīng)當(dāng)外源基因被移人受體植物中之后，它在不同的轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平往往有 很大差異。這主要是

42、由于外源基因在受體植物的基因組內(nèi)插入位點(diǎn)不同造成的。這就 是所謂的”位置效應(yīng)”。為了消除位置效應(yīng)，使外源基因都能夠整合在植物基因組的轉(zhuǎn) 錄活躍區(qū)，在目前的表達(dá)載體構(gòu)建策略中通常會(huì)考慮到核基質(zhì)結(jié)合區(qū)以及定點(diǎn)整合技 術(shù)的應(yīng)用。核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrix association regi on ,MAR）是存在于真核細(xì)胞染色質(zhì)中的一段與核基質(zhì)特異結(jié)合的DNA序列。一般認(rèn)為，MAR序列位于轉(zhuǎn)錄活躍的DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)哉的邊界，其功能是造成一種分割作用，使每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元保持相對(duì)的獨(dú)立性，免受周圍染色質(zhì)的影響。有關(guān)研究表明，將MAR置于目的基因的兩側(cè)，構(gòu)建成包含MAR-ge ne-MAR結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體，用于

43、遺傳轉(zhuǎn)化，能明顯提高目的基因的表達(dá) 水平，降低不同轉(zhuǎn)基因植株之間目的基因表達(dá)水平的差異，減少位置效應(yīng)。例如，Allen等人研究了異源MAR（來(lái)自酵母）和同源MAR（來(lái)自煙草）對(duì) |Gus 基因在煙草中表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)酵母的MAR能使轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平平均提高12倍，而煙草本身的MAR能使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平平均提高60倍。使用來(lái)源于雞溶菌酶基因的MAR也可起到同樣作用。另一可行的途徑是采用定點(diǎn)整合技術(shù)，這一技術(shù)的主要原理是，當(dāng)轉(zhuǎn)化載體含有 與寄主染色體同源的DNA片段時(shí)，外源基因可以通過(guò)同源重組定點(diǎn)整合于染色體的 特定部位。實(shí)際操作時(shí)首先要分離染色體轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的DNA片段，然后構(gòu)建植物表達(dá)載體。在微

44、生物的遺傳操作中，同源重組定點(diǎn)整合已成為一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，在動(dòng)物 中外源基因的定點(diǎn)整合已獲得成功，而在植物中除了葉綠體表達(dá)載體可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合以外，細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中還很少有成功的報(bào)道。4構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體為了克服細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中經(jīng)常出現(xiàn)的外源基因表達(dá)效率低，位置效應(yīng)及由于核基因隨花粉擴(kuò)散而帶來(lái)的不安全性等問(wèn)題，近幾年出現(xiàn)的一種新興的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)-葉綠體轉(zhuǎn)化，正以它的優(yōu)越性和發(fā)展前景日益為人們所認(rèn)識(shí)并受到重視。到目前為止，已在煙草、水稻、擬南芥、馬鈴薯和油菜（侯丙凱等，等發(fā)表）5種植物中相繼實(shí)現(xiàn)了葉綠體轉(zhuǎn)化，使得這一轉(zhuǎn)化技術(shù)開始成為植物基因工程中新的生長(zhǎng)點(diǎn)。由于目前多種植物的葉綠體基因組全序列已被測(cè)定，這就為

45、外源基因通過(guò)同源重組機(jī)制定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基因組奠定了基礎(chǔ)，目前構(gòu)建的葉綠體表達(dá)載體基本上都屬于定點(diǎn)整合載體。構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體基本上都屬于定點(diǎn)事例載體。構(gòu)建葉綠體表達(dá) 載體時(shí)，一般都在外源基因表達(dá)盒的兩側(cè)各連接一段葉綠體的DNA序列，稱為同源重組片段或定位片段（Targeting fragment）。當(dāng)載體被導(dǎo)入葉綠體后，通過(guò)這兩個(gè)片段與葉綠體基因組上的相同片段發(fā)生同源重組，就可能將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點(diǎn)。在以作物改良為目的的葉綠體轉(zhuǎn)化中，要求同源重組發(fā)生以后，外源 基因的插入既不引起葉綠體基因原有序列丟失，又不致于破壞插入點(diǎn)處原有基因的功能。為滿足這一要求，已有的工作都選用了相

46、鄰的兩個(gè)基因作為同源重組片段，例如rbcL/accD，16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB。當(dāng)同源重組發(fā)生以后，外源基因定點(diǎn)插入在兩個(gè)相鄰基因的間隔區(qū)，保證了原有基因的功能不受影響。最近，Dan iel等利用煙草葉綠體基因trnA和trnI作為同源重組片段，構(gòu)建了一種通用載體(universalvector)。由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的，作者認(rèn)為這種載 體可用于多種不同植物的葉綠體轉(zhuǎn)化。如果這種載體的通用性得到證實(shí)，那么這項(xiàng)工 作無(wú)疑為構(gòu)建方便而實(shí)用的新型葉綠體表達(dá)載體提供了一個(gè)好的思路。由于葉綠體基因組的高拷貝性，定點(diǎn)整合

47、進(jìn)葉綠體基因組的外源基因往往會(huì)得到高效率表達(dá)，例如McBride等人首次將Bt CrylA(c)毒素基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，Bt毒素蛋白的表達(dá)量高達(dá)葉子總蛋白的3%5%，而通常的核轉(zhuǎn)化技術(shù)只能達(dá)到0.001%0.6%。最近，Kota等將Bt Cry2Aa2蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，也發(fā)現(xiàn)毒蛋 白在煙草葉子中的表達(dá)量很高，占可溶性蛋白的2%3%，比細(xì)胞核轉(zhuǎn)化高出2030倍，轉(zhuǎn)基因煙草 不僅能抗敏感昆蟲，而且能夠百分之百地殺死那些產(chǎn)生了高抗性的昆 蟲。Staub等最近報(bào)道，將人的生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，其表達(dá)量竟高達(dá)葉片 總蛋白的7%，比細(xì)胞核轉(zhuǎn)化高出300倍。 這些實(shí)驗(yàn)充分說(shuō)明，葉綠體表達(dá)

48、載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化，是實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的重要途徑之一。5定位信號(hào)的應(yīng)用上述幾種載體優(yōu)化策略主要目的是提高外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率， 然而， 高水 平表達(dá)的外源蛋白能否在植物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在以及積累量的多少是植物遺傳轉(zhuǎn)化中 需要考慮的另一重要問(wèn)題。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，如果某些外源基因連接上適當(dāng)?shù)亩ㄎ恍盘?hào)序列，使外源蛋白產(chǎn)生后定向運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的特定部位，例如：葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡等，則可明顯提 高外源蛋白的穩(wěn)定性和累積量。這是因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)等特定區(qū)域?yàn)槟承┩庠吹鞍滋峁┝艘粋€(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，有效防止了外源蛋白的降解。例如，Wong等將擬南芥rbcS亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列連接于殺蟲蛋白基因之前，發(fā)現(xiàn)殺蟲蛋白能夠

49、特異性地積累在轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠體內(nèi)，外源蛋白總的積累量比對(duì)照提高了1020倍。最近，葉梁、宋艷茹等也將rbcS亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列連接于PHB合成相關(guān)基因之前，試圖使基因表達(dá)產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因油菜種子的質(zhì)體中積累， 從而提高外源蛋白含量。 另外，Wan delt等和Schouten等將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列(四肽KDEL的編碼序列)與外源蛋白基因相連接，發(fā) 現(xiàn)外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的含量有了顯著提高。顯然，定位信號(hào)對(duì)于促進(jìn)蛋白質(zhì)積 累有積極作用，但同一種定位信號(hào)是否適用于所有的蛋白還有待于進(jìn)一步確定。6內(nèi)含子在增強(qiáng)基因表達(dá)方面的應(yīng)用內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的作用最初是由Callis等在轉(zhuǎn)基因玉米中發(fā)現(xiàn)的，玉米乙醇脫氫

50、酶基因(Adhl)的第一個(gè)內(nèi)含子(intron 1)對(duì)外源基因表達(dá)有明顯增強(qiáng)作用，該 基因的其他內(nèi)含子(例如intron8,intron9)也有一定的增強(qiáng)作用。后來(lái)，Vasil等也發(fā)現(xiàn)玉米的果糖合成酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子能使CAT表達(dá)水平提高10倍。水稻肌動(dòng)蛋白基因的第三個(gè)內(nèi)含子也能使報(bào)道基因的表達(dá)水平提高26倍。至今對(duì)內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的機(jī)制不不清楚，但一般認(rèn)為可能是內(nèi)含子的存在增強(qiáng)了mRNA的加工效率和mRNA穩(wěn)定性。Tan aka等人的多項(xiàng)研究表明，內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的增強(qiáng)作用主要發(fā)生在單子葉植物，在雙子葉植物中不明顯。由于內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)有增強(qiáng)作用，Mcelroy等在構(gòu)建單子葉植物表達(dá)載體

51、時(shí)，特意將水稻的肌動(dòng)蛋白基因的第一個(gè)內(nèi)含子保留在該基因啟動(dòng)子的下游。同樣,Christensen等在構(gòu)建載體時(shí)將玉米Ubiquitin基因的第一個(gè)內(nèi)含子置于啟動(dòng)子下游,以增強(qiáng)外源基因在單子葉植物中的表達(dá)。然而，有研究指出，特定內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá) 的促進(jìn)作用取決于啟動(dòng)子強(qiáng)度、細(xì)胞類型、目的基因序列等多種因素，甚至有時(shí)會(huì)取例如，玉米Adhl基因的內(nèi)含子9置于|Gus 基因的5端， Gus 基因的表達(dá)未見(jiàn)增強(qiáng)；當(dāng)把內(nèi)含子置于|Gus 基因3Gus 基因的表達(dá)水平卻增加了大約3倍。由此可見(jiàn)，內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的作用機(jī)制可能是很復(fù)雜的，如何利用內(nèi)含子構(gòu)建高效植物表達(dá)載 體，目前還缺乏一個(gè)固定的模式，值得進(jìn)一

52、步探討。7多基因策略迄今為止，多數(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究都是將單一的外源基因轉(zhuǎn)入受體植物。但有時(shí)由 于單基因表達(dá)強(qiáng)度不夠或作用機(jī)制單一，尚不能獲得理想的轉(zhuǎn)基因植物。如果把兩個(gè)或兩個(gè)以上的能起協(xié)同作用的基因同時(shí)轉(zhuǎn)入植物，將會(huì)獲得比單基因轉(zhuǎn)化更為理想的結(jié)果。這一策略在培育抗病、抗蟲等抗逆性轉(zhuǎn)基因植物方面已得到應(yīng)用。例如，根據(jù) 抗蟲基因的抗蟲譜及作用機(jī)制的不同，可選擇兩個(gè)功能互補(bǔ)的基因進(jìn)行載體構(gòu)建，并 通過(guò)一定方式將兩個(gè)抗蟲基因同時(shí)轉(zhuǎn)入一個(gè)植物中去。王偉等將外源凝集素基因和蛋白酶抑制劑基因同時(shí)轉(zhuǎn)入棉花，得到了含雙價(jià)抗蟲基因的轉(zhuǎn)化植株。Barton等將Bt殺蟲蛋白基因和蝎毒素基因同時(shí)轉(zhuǎn)入煙草，其抗蟲性和防止害

53、蟲產(chǎn)生抗性的能力大為提咼（專利）。在抗病方面，本實(shí)驗(yàn)室藍(lán)海燕等構(gòu)建了包含3-1,3-葡聚糖酶基因及幾丁質(zhì)酶基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入油菜和棉花，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株均產(chǎn)生了明顯的抗病性。最近，馮道榮、李寶健等將23個(gè)抗真菌病基因和hpt基因連在一個(gè)載體上，兩個(gè)抗蟲基因與bar基因連在另一個(gè)載體上，用基因槍將它們共同導(dǎo)入水稻植株中，結(jié)果表明，70%的R。代植株含有導(dǎo)入的全部外源基因（67個(gè)），且導(dǎo)入的多個(gè)外源基因趨向于整合在基因組的一個(gè)或兩個(gè)位點(diǎn)。一般常規(guī)的轉(zhuǎn)化，尚不能將大于25kb的外源DNA片段導(dǎo)入植物細(xì)胞。而一些功能相關(guān)的基因，比如植物中的數(shù)量性狀基因、抗病基因等，大多成”基因簇”的形式存在。如果將某些大于100kb的大片段DNA,如植物染色體中自然存在的基因簇或并不 相連鎖的一系列外源基因?qū)胫参锘蚪M的同一位點(diǎn)，那么將有可能出現(xiàn)由多基因控制的優(yōu)良性狀或產(chǎn)生廣譜的抗蟲性、抗病性等，還可以賦予受體細(xì)胞一種全新的代謝 途徑，產(chǎn)生新的生物分子。決于內(nèi)含子在載體上的位置。在CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下,端，在同樣的啟動(dòng)子控制下，不僅如此，大片段基因群或基因簇的同步插入還可以在一 定程度上克服轉(zhuǎn)基因帶來(lái)