菱角皮提取物中鞣酸類化合物的含量測定及其指紋圖譜研究

1、菱角皮提取物中鞣酸類化合物的含量測定及其指紋圖譜研究                         作者：符少蓮，周光雄，黃美燕【摘要】 目的建立菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣質(zhì)類化合物的HPLC含量測定方法，并對提取物HPLC指紋圖譜條件進(jìn)行研究分析。方法采用反相C18柱（4.6 mm×200 mm，5 m），甲醇0.5%乙酸水溶液為流動相，梯度洗脫

2、，柱溫為25，流速為0.8 ml/min，在276 nm下進(jìn)行檢測。結(jié)果菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣質(zhì)類化合物1,2,6-三沒食子酰-D-葡萄糖的含量為85.7 mg/g，加樣回收率為92.49%；1,2,4,6-四沒食子酰-D-葡萄糖的含量為244 mg/g，加樣回收率為96.41%；初步探討了菱角皮提取物的指紋圖譜條件。結(jié)論采用高效液相法測定菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣質(zhì)類化合物的含量，簡便、快速、準(zhǔn)確；初步得到分離菱角皮提取物各特征峰的色譜條件，為以后建立指紋圖譜和制定菱角皮藥材及其活性提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】 菱； 果皮； 鞣酸； 高效液相色譜； 指紋圖譜Abstract：Ob

3、jective To establish determination method of tannin compounds from bioactive ethyl acetate extract of the fruit crust of Trapa bispinosa Roxb by HPLC, and to study on analysis conditions of HPLC fingerprint of the extract. MethodsUse reverse phase C18 column（4.6 mm×200 mm，5 m）, detection wave-l

4、ength at 276 nm, column temperature at 25, flow rate at a 0.8 ml/min, and gradient aqueous methanol solution containing 0.5% acetic acid as a mobile phase.ResultsThe determination of tannic acid compound 1, 2, 6-tri-galloyl- D-glucose from the extract was 85.7mg/g, and the average recoveries was 92.

5、49%; the determination of tannic acid compound 1, 2, 3, 6-tetra-galloyl-D -glucose was 244 mg/g, and the average recoveries was 96.41%; a preliminary study on conditions of HPLC fingerprint for the bioactive extract was carried out. ConclusionThe determination method for the tannin compounds from et

6、hyl acetate extract of the fruit crust of the plant by HPLC is simple, fast and accurate. Chromatographic conditions of ethyl acetate extract of the plant was initially obtained, which provide the basis for establishment of the HPLC fingerprint and making quality standard of the crude drug and its b

7、ioactive extract from the plant.Key words：Trapa bispinosa Roxb; Fruit crust; Tannin; HPLC；Fingerprint 菱Trapa bispinosa Roxb，一年生浮水或半挺草本，屬菱科。我國有15種和11變種，產(chǎn)于全國各地，以長江流域亞熱帶地區(qū)分布與栽培最多1。其性甘味涼，無毒，入腸、胃二經(jīng)，有清熱祛暑、除濕祛風(fēng)、益氣健脾之功2。菱殼，為菱科植物菱或其同屬植物的果皮。其作為藥物始載于本草綱目拾遺。據(jù)中華藥海所載，其性味微苦、澀，涼，入肺、脾、大腸三經(jīng)，具有解毒療瘡、澀湯止瀉、清化濕熱的功效2。 經(jīng)查閱文

8、獻(xiàn)得知，東北菱T. manshurica Flerov菱角的提取物確實有一定的抗腫瘤活性35。在我們的前期工作中，選取菱Trapa bispinosa Roxb的菱角皮作為研究對象，采用MTT法對菱角皮提取物抗肝癌HepG2細(xì)胞活性成分進(jìn)行活性追蹤，采用液液萃取提取物各極性部位，也證實了菱角皮醋酸乙酯提取物對HepG2細(xì)胞有一定的抑制作用；采用反相C18柱層析和sephadex LH-20排阻層析分離活性成分，得到兩個鞣質(zhì)類化合物1, 2, 6-三沒食子酰-D-葡萄糖（1）和1, 2, 4, 6-四沒食子酰-D-葡萄糖（2），對該兩個化合物進(jìn)行了抗癌活性實驗，證實其對HepG2細(xì)胞有一定的抑制

9、作用（待發(fā)表）。此前，有研究表明存在于東北菱菱角中的沒食子酸具有誘導(dǎo)Hela腫瘤細(xì)胞凋亡的作用3。兩個化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。                              本研究將對菱角皮的醋酸乙酯活性部位中鞣質(zhì)類化合物進(jìn)行HPLC定性定量方法研究，旨在建立HPLC含量測定方法，并對菱角皮醋酸乙酯提取物H

10、PLC指紋圖譜條件進(jìn)行研究分析。1 儀器與材料1.1 儀器Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀，電子天平（ACCULAB sartorius group），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA）。1.2 藥材菱殼為從湖南長沙購買的菱角（第1批）、江西采集的菱角（第2批）和購買的菱角（第3批）果實去肉后的硬殼，藥材經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為菱Trapa bispinosa Roxb的果殼。藥材樣品留存于暨南大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室。1.3 標(biāo)準(zhǔn)品1, 2, 6-三沒食子酰-D-葡萄糖（1）、 1, 2, 4, 6-四沒食子酰-D-葡萄糖（2）和沒食子酸（3）對照

11、品為本實驗室提純物,其中（1）和（2）為從該實驗提取物中分離得到，并經(jīng)光譜法鑒定結(jié)構(gòu)。甲醇為色譜純，江蘇漢邦科技有限公司產(chǎn)品；其余試劑為分析純。2 方法與結(jié)果2.1 HPLC定量分析 精密稱取0.004 1 g，化合物2置5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成0.82 mg/ml的化合物2標(biāo)準(zhǔn)液。 精密稱取化合物30.002 1 g，置5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成0.46 mg/ml的化合物3標(biāo)準(zhǔn)液。 結(jié)果表明化合物1在0.009 20.046 mg/ml，化合物2在0,01640.082 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。   

12、0;         化合物1加樣回收率實驗:精密稱取化合物1 0.002 6 g于25 ml容量瓶，并精密稱取0.002 1 g菱角皮醋酸乙酯提取物于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度；再分別吸取該化合物1溶液1 ml和菱角皮醋酸乙酯提取物溶液5 ml于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度；吸取20 ml進(jìn)樣測定，按該法平行測量3次。結(jié)果見表3。表3 化合物1加樣回收率實驗結(jié)果（略） 化合物2加樣回收率實驗：結(jié)果見表4。表4 化合物2加樣回收率試驗結(jié)果（略）2.2 指紋圖譜研究 由圖35可得，3個藥材都在5.645

13、，22.803，24.314，25.66，45.66，48.391，52.406 min左右出現(xiàn)特征色譜峰。 分別吸取化合物1，2，3對照品溶液于該色譜條件下進(jìn)樣，可知5.645 min色譜峰為沒食子酸，22.803 min色譜峰為化合物1，25.66 min色譜峰為化合物2。3 討論 本研究對菱角皮抗腫瘤活性部位兩個鞣酸類主要成分1，2, 6-三沒食子酰-b-D-葡萄糖和1, 2, 4, 6-四沒食子酰-b-D-葡萄糖首次進(jìn)行了定量分析方法研究并進(jìn)行了樣品HPLC定量分析，首次初步分析了菱角皮醋酸乙酯提取物活性部位的HPLC指紋圖譜。結(jié)果表明采用高效液相法可測定菱角皮醋酸乙酯提取物中兩個鞣酸

14、類化合物的含量，具有簡便、快速、準(zhǔn)確特點，所建立的HPLC提取物指紋圖譜分析方法可用于該活性部位質(zhì)量控制。選用文獻(xiàn)報道的流動相甲醇-0.5%乙酸水溶液進(jìn)行分離，化合物1、2峰形良好，但是大量極性相對較低的雜質(zhì)吸附在色譜柱上無法洗脫, 嚴(yán)重影響后續(xù)的含量測定。所以, 本實驗采取固相萃?。⊿PE）和梯度洗脫步驟, 去除這一些雜質(zhì)干擾,保證了后續(xù)HPLC指紋圖譜和定量分析順利進(jìn)行。 初步得到分離菱角皮提取物各特征峰的色譜條件，也為以后進(jìn)一步完善建立提取物指紋圖譜分析方法和制定菱角皮藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1吳征鎰.中國植物志，53卷二分冊M.北京：科學(xué)出版社,2000:1.2冉先德.中華藥海M.哈爾濱：哈爾濱出版社，1993：1584.3牛鳳蘭，伊健元，董威嚴(yán)菱角中抗腫瘤活性成分的分離、提純及結(jié)構(gòu)鑒定J.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2005，26(5)：852.4牛鳳蘭，李晨旭，董威嚴(yán).東北菱提取物對肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用J.吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2002，30(4)：553.