U46619對培養(yǎng)的人氣道平滑肌細(xì)胞增殖的作用

1、    U46619對培養(yǎng)的人氣道平滑肌細(xì)胞增殖的作用羅雅玲文金序彭道波徐健 摘要目的和方法：研究U46619(9，11-dideoxy-11，9-epoxymethano-prostaglandin F2)對培養(yǎng)的人氣管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。分離人的氣管平滑肌細(xì)胞并且進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中加入各種濃度的U46619，計數(shù)細(xì)胞并且測定3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入量和三磷酸肌醇Ins(1,4,5)P3累積量。結(jié)果：U46619在一定范圍內(nèi)(1 nmol/L100 nmol/L)以濃度依賴的方式增加人氣管平滑肌的細(xì)胞數(shù)(P0.01)。U46619

2、也增加3H-TdR的摻入量和Ins(1，4，5)P3的累積量(P0.01)。磷脂酶C抑制劑新霉素阻止Ins(1，4，5)P3累積量的增加（P0.01)，但對U46619的有絲分裂原的活性沒有作用。結(jié)論：顯示U46619刺激培養(yǎng)的人氣管平滑肌細(xì)胞增殖。 主題詞肌，平滑；增生；哮喘 Role of U46619 for proliferation of cultured human airway smooth muscle cell LUO Ya-Ling1,WEN Gin-Xu1, XU Jian2, PENG Dao-Bo1 Department of Respiratory Medicine

3、1,Renal Transplantion2,Nan Fang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou(510515) Abstract AIM：To study the role of U46619 in stimulating the proliferation of cultured human airway smooth muscle cell (ASMC).METHODS：Human ASMC were isolated and subcultured, varying concentrations of

4、U46619 were added to the media. Cell counts were obtained,3H -thymidine incorporation (3H-TdR) and inosital 1，4，5-trisphosphate Ins(1，4，5)P3 accumulation were measured.RESULTS：U46619(1 nmol/L-100 nmol/L) increased cell number in a concentration depend manner (P0.01) U46619 also increased 3H-TdR and

5、(1,4,5)P3 accumulation (P0.01). The latter response was blocked by phospholipase C inhibition with neomycin (P0.01)，however, neomycin had no effect on the promitogenic action of U46619.CONCLUSION： U46619 stimulates the proliferation of cultured human ASMC. MeSHMuscle, smooth; Hyperplasia; Asthma 血栓素

6、A2(thromboxane A2，TXA2)是花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧化酶途徑代謝的主要產(chǎn)物之一，能強烈地收縮血管和氣管平滑肌，其收縮血管的作用比血管緊張素強100倍1。TXA2性質(zhì)不穩(wěn)定，半衰期短。近來的研究顯示：氣道平滑肌的增生是引起哮喘患者氣道狹窄的重要因素2。許多炎性介質(zhì)如組胺、內(nèi)皮素-1、白三烯D4等均能引起氣管平滑肌增殖3，4，已有報道TXA2引起兔氣管平滑肌增殖5。我們通過離體培養(yǎng)的人氣管平滑肌細(xì)胞，觀察TXA2穩(wěn)定的類似物U46619對其增殖的作用。 材料與方法 一、標(biāo)本來源： 意外事故死亡的正常人，征得家屬同意，在死亡2 h之內(nèi)，取靠近隆突的支氣管平滑肌作實驗。 二、主要試劑： U

7、46619 新霉素、消炎痛、Ham's F-12 培養(yǎng)基，抗平滑肌-肌動蛋白均購自Sigma公司。 三、實驗方法： 1.人氣管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)：無菌切下鄰近隆突的氣管，用Hanks液洗滌3遍，去除上皮，結(jié)締組織、血管、軟骨，用虹膜剪將氣管平滑肌剪成12 mm的小塊組織置于培養(yǎng)瓶底部，呈陣狀排列。將培養(yǎng)瓶放入孵箱。12 h后組織塊貼壁，加入含有20%胎牛血清的F-12培養(yǎng)基。細(xì)胞7 d開始生長，14 d達(dá)到融合。融合時用0.25%胰蛋白酶和0.04%的EDTA等量混合后消化傳代，24代的氣管平滑肌細(xì)胞用于實驗。 2.人氣管平滑肌細(xì)胞鑒定：用抗平滑肌肌動蛋白單克隆抗體辨認(rèn)人氣管平滑肌細(xì)胞。

8、3.U46619對人氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響： (1)細(xì)胞計數(shù)：第二代人氣管平滑肌細(xì)胞，以1×107細(xì)胞/L的密度接種于培養(yǎng)瓶中，用有血清的F-12培養(yǎng)24 h后，再用無血清的F-12培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步靜止于G°期，每3瓶分別加入含有1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L的U46619的無血清F-12培養(yǎng)基，另有兩組分別加入1 新霉素、100 nmol/L U46619及10 mol/L消炎痛、100 nmol/L U46619的無血清F-12培養(yǎng)基，對照細(xì)胞單獨用無血清的F-12培養(yǎng)，48 h后計數(shù)細(xì)胞。 (2)3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)

9、摻入試驗：傳代細(xì)胞以1×107細(xì)胞/L接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL。用無血清的F-12培養(yǎng)24 h后，每3孔分別加入含有1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 mol/L的U46619，或者含有1 mol/L的新霉素、100 nmol/L的U46619，或者含有10 mol/L的消炎痛，100 nmol/L的U46619的無血清F-12培養(yǎng)基，另外3孔作為對照組單獨加入無血清的F-12。24 h后，用37×107Bq/L的3H-TdR(Amersham,放射比度1.85 GBq/mol)標(biāo)記12 h，于終點常規(guī)消化，收集細(xì)胞、洗滌干燥，測每分鐘放

10、射性核素閃爍記數(shù)值(countsmin-1)。 4.U46619對Ins(1，4，5)P3累積量的影響：傳代細(xì)胞以1×104細(xì)胞/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，用含有20%胎牛血清的F-12培養(yǎng)基孵化1周后，分別加入1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L的U466195 min，另外3瓶細(xì)胞加入1 mol/L的新霉素2 h后加入10 nmol/L的U466195 min，還有3瓶作為對照組。細(xì)胞被標(biāo)準(zhǔn)化到1×106細(xì)胞，用6%的高氯酸溶解，碳酸氫鈉中和，保持在冰中1 h，離心(20 000×g，4，25 min)，后取出1 000 L上清液，用放

11、射性配基竟?fàn)幗Y(jié)合法測定Ins(1，4，5)P3累積量(Amersham) 四、數(shù)據(jù)表達(dá)方式和統(tǒng)計方法： 細(xì)胞計數(shù)以細(xì)胞數(shù)/cm2及百分?jǐn)?shù)表達(dá)。實驗組的百分?jǐn)?shù)實驗組細(xì)胞計數(shù)/對照組細(xì)胞計數(shù))×100%。3H-TdR以countsmin/L及百分?jǐn)?shù)表達(dá)。實驗組3H-TdR的百分?jǐn)?shù)(實驗組3H-TdR/對照組3H-TdR)×100%。Ins(1，4，5)P3以pmol/106細(xì)胞及百分?jǐn)?shù)表達(dá)。實驗組Ins(1，4，5)P3的百分?jǐn)?shù)實驗組Ins(1，4，5)P3/對照組Ins(1,4,5)P3×100%。 實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，用ANOVA及Stude

12、nt's test判定差異顯著性。 結(jié)果 一、U46619對人氣管平滑肌細(xì)胞增殖的作用： 表1可以看出U46619引起的細(xì)胞數(shù)的變化在一定范圍內(nèi)(1 nmol/L100 nmol/L)以濃度依賴的方式增加，以100 nmol/L的U46619引起的細(xì)胞數(shù)增長的峰值最高。磷脂酶C抑制劑1 mol/L的新霉素和環(huán)氧化酶抑制劑10 mol/L消炎痛對于100 nmol/L的U46619引起的細(xì)胞數(shù)增長沒有抑制作用。 表1U46619對培養(yǎng)的人氣管平滑肌細(xì)胞增殖的作用 Tab 1The effect of U46619 on cultured airway smooth muscle cell

13、 (ASMC) proliferation (，n=3) Group Concentration (nmol/L) ASMC count (cell/cm2) Proliferation (% control) Control No stimulation 1990±1650 U46619 1 21600±700* 108.71±3.53 10 23500±780* 117.90±3.89 100 29300±850* 147.07±4.28 1000 22000±820* 110.56±4.11 U46

14、619+neomycin 1001×103 29000±1970* 145.90±9.92 U46619+indomethacin 10010×103 29700±3100* 149.08±15.52 *P0.01，vs control 二、U46619對人氣管平滑肌細(xì)胞3H-TdR結(jié)合的影響： 表2可見U46619引起的3H-TdR結(jié)合在一定范圍內(nèi)(1 nmol/L100 nmol/L)呈劑量依賴性增長，以100 nmol/L的U46619引起的3H-TdR增加的峰值最高。磷脂酶C抑制劑1 mol/L的新霉素的和環(huán)氧化酶抑制劑10

15、mol/L的消炎痛對于100 nmol/L的U46619引起的3H-TdR的增加沒有抑制作用。 表2U46619對培養(yǎng)的人氣管平滑肌細(xì)胞3H-胸腺嘧啶 核苷結(jié)合的作用 Tab 2The effect of U46619 on 3H-Thymidine(3H-TdR) incorporation in cultured human ASMC (，n=3) Group Concentration (nmol/L) 3H-TdR (×103 counts.min-1/L) Proliferation (% control) Control 11810±1013 U46619 1

16、13984±1603* 118.41±13.57 10 15040±1319* 127.35±11.17 100 18316±890* 155.09±7.54 1 000 13340±900* 112.96±7.62 U46619+neomycin 1001×103 18146±1894* 153.65±16.04 U46619+indomethacin 10 010×103 18494±724* 156.46±5.89 *P0.01，vs control

17、 三、U46619對人氣管平滑肌細(xì)胞Ins(1，4，5)P3累積的影響： 表3可見U46619可引起Ins(1，4，5)P3累積的增加。其中以10 nmol/L的U46619引起細(xì)胞Ins(1，4，5)P3累積量最高。1 mol/L的新霉素對10 nmol/L的U46619引起的Ins(1，4，5)P3累積量的增加有一定的抑制作用(P0.01)。 表3U45519對培養(yǎng)的人氣管平滑肌細(xì)胞三磷酸肌醇累積量的作用 Tab 3The effect of U46619 on inositol 1，4，5-trisphosphate Ins(1，4，5)P3accumulation in culture

18、d human ASMC(，n=3) Group Concentration (nmol/L) Ins(1,4,5)P3 (cell/cm2) Proliferation (% control) Control 11.94±1.19 U46619 1 25.19±1.86* 210.97±15.61 10 39.91±2.19* 334.23±18.37 100 19.87±2.08* 166.47±17.43 U46619+neomycin 101 000 21.30±1.93* 178.42±16.1

19、5 *P0.01，vs control 討論 血栓素A2在肺內(nèi)的主要生物學(xué)活性是引起血管和氣管平滑肌收縮，同時參加氣道高反應(yīng)性的發(fā)生6。我們的研究證實血栓素A2的類似物U46619能刺激人的氣管平滑肌細(xì)胞增殖。它能增加體外培養(yǎng)的人氣管平滑肌的細(xì)胞數(shù)，增加3H-TdR結(jié)合量和Ins(1，4，5)P3累積量。過去10年，人們對哮喘發(fā)病機理和病理生理學(xué)基礎(chǔ)的認(rèn)識產(chǎn)生了一個巨大的飛躍。認(rèn)識到哮喘是氣道的一種非特異性炎癥。以嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞為主要作用細(xì)胞。病理改變是上皮剝脫、粘膜水腫，炎癥細(xì)胞浸潤，微血管滲漏等7。人們把研究的目光都集中在氣道炎癥方面。但是近來發(fā)現(xiàn)以吸入表面激素為主的抗炎治療不能根

20、治哮喘。實際上哮喘患者的氣道壁發(fā)生了不同程度的增殖，使管壁增厚，管腔變窄8，氣道發(fā)生了重塑。根據(jù)Bramley等的假設(shè)進(jìn)行計算9，平滑肌的肥大或增生有可能是哮喘產(chǎn)生氣道阻塞的主要作用因素。因此，哮喘氣管壁的重塑的結(jié)構(gòu)改變引起了功能的改變，對于研究哮喘的病理生理學(xué)改變和臨床防治提供了一個新方向10。 作者單位:羅雅玲文金序彭道波第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院呼吸科 徐健腎移植科(廣州510515) 參考文獻(xiàn) 1MaJerus PW. Antithrombotic therapy. Drug Therapy, 1983,10:51. 2Hirst SJ, Twort CHC. The proliferati

21、ve response of airway smooth muscle. Clin Exp Allergy, 1992,22:907. 3Noveral JP, Rosenberg SM, Anbar RA, et al.Role of endothelin-1 in regulating proliferation of cultured rabbit airway smooth muscle cells. Am J Physiol, 1992,263:L317. 4Wang CG, Du T, XuL J, et al. Role of leukotriene D4 in allergen induced in creases in smooth muscle in the rat. Am Rev Respir Dis,1993, 148:413. 5Noveral JP, Michael MG. Role and mechanism of thromboxane-induced proliferation of cultured airway smooth muscle cells. Am J Physiol, 1992,263:L555