喘復(fù)康合劑對(duì)支氣管哮喘大鼠氣道重塑和CD44表達(dá)的影響

1、喘復(fù)康合劑對(duì)支氣管哮喘大鼠氣道重塑和CD44表達(dá)的影響    【摘要】  目的觀察喘復(fù)康合劑對(duì)支氣管哮喘大鼠氣道重塑的影響及其可能的作用機(jī)制。方法采用卵白蛋白致敏法復(fù)制大鼠哮喘模型，以喘復(fù)康合劑灌胃給藥后，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中CD44表達(dá)的變化；通過圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組大鼠支氣管壁各層的厚度；通過Masson三色染色法及圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組大鼠膠原沉積厚度。結(jié)果哮喘組肺組織中CD44的含量明顯高于對(duì)照組（P<0.05），4周組較3周組更為明顯；激素組CD44表達(dá)不明顯，與對(duì)照組相比無顯著性差異（P>0.0

2、5）。喘復(fù)康低、高劑量組CD44的含量明顯低于哮喘組（P<0.05）。圖像分析結(jié)果顯示，哮喘組支氣管平滑肌明顯增厚，膠原沉積增加，4周組較3周組更為明顯，與對(duì)照組比較有顯著性差異（P<0.05），激素組與喘復(fù)康組平滑肌增厚不明顯，與對(duì)照組相比無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論 喘復(fù)康合劑能夠抑制哮喘大鼠氣道重塑的形成，可能是通過減少肺組織中CD44的產(chǎn)生和表達(dá)而發(fā)揮的，與激素作用結(jié)果相似。 【關(guān)鍵詞】  哮喘 氣道重塑 喘復(fù)康大鼠Abstract：ObjectiveTry to observe the effect and possible mechanism of

3、 ChuanFuKang mixture on airway remodell of rat models of asthma.MethodsAn animal model of asthma was established by OVA (ovalbumin) sensitizing-challenging SD rat. Water extract of ChuanFuKang were given to rats(ig). Immunohistochemical technology was used to estimate the change of CD44 in the rat l

4、ung tissues of each group, the thickness of bronchial wall and the area of collagen deposition was detected by computer image analyse system and by method of Masson trichrome staining.ResultsThe content of CD44 of lung tissue of asthma group was significantly higher than that of control group (P0.05

5、), the four-week group was more obvious than the three-week group. The content of CD44 of low dose and high dose group was obviously lower than that of asthma group(P0.05). The results of the image analysis showed that the thickness of bronchial smooth muscle and the area of collagen deposition obvi

6、ously increased, the four-week group was more evident than the three-week group, there was significant difference compared with control group(P0.05). These changes of hormone group and ChuanFuKang group were not evident, there was no significant difference compared with control group(P0.05).Conclusi

7、onChuanFuKang mixture can inhibite the airway remodeling by reducing the produce and the expression of CD44 in asthmatic rat lung tissue.Key words：Asthma;  Airway remodeling;  ChuanFuKang Rats    支氣管哮喘(簡稱哮喘)是嚴(yán)重影響人體健康的慢性呼吸道炎癥性疾病。近年來，人們針對(duì)哮喘病的慢性進(jìn)行性和難以根治性，對(duì)于哮喘氣道壁重塑的研究日益受到重視。氣道重塑

8、主要表現(xiàn)為氣道平滑肌肥大、增生、基底膜增厚和玻璃樣變，由此可致氣道的不可逆阻塞和持續(xù)的氣道高反應(yīng)性，是頑固性哮喘的重要病理基礎(chǔ)1。許多因素如炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子及原癌基因都參與了這一過程。本研究觀察不同時(shí)段哮喘大鼠模型肺組織中CD44的表達(dá)及藥物對(duì)其表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步闡明CD44在哮喘氣道重構(gòu)中的作用和藥物的干預(yù)機(jī)制，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。1  材料與方法1.1  藥品與試劑  雞卵清白蛋白（OVA），美國Sigma公司;地塞米松磷酸鈉注射液，湖北天藥藥業(yè)；兔抗鼠CD44多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；SP免疫組織

9、化學(xué)、DAB顯色試劑盒，北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。1.2  儀器  402T型超聲霧化器，上海四菱醫(yī)療器械廠；自制大鼠霧化吸入箱；DC200圖象采集系統(tǒng)、IM50型圖像采集軟件、Image-Proplus真彩色醫(yī)學(xué)圖象分析軟件，德國Leica公司產(chǎn)品等。1.3  動(dòng)物及分組  健康雄性SD大鼠80只，體重180200 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物于正常溫控、光照和自由攝取食物、水的條件下飼養(yǎng)1周后，被隨機(jī)分成5組：正常對(duì)照組、哮喘組、地塞米松處理組及喘復(fù)康低劑量和高劑量處理組。各組又分成誘喘3周、4周兩個(gè)時(shí)間段。1.4&#

10、160;  大鼠哮喘模型的建立  采用卵白蛋白（OVA）致敏法制備2。第1天，哮喘組及各給藥組大鼠用1ml混懸液腹腔注射OVA 10 mg；Al(OH)3干粉100 mg致敏，第15天開始誘喘，哮喘組大鼠超聲霧化1%OVA激發(fā)，約30 min/次，觀察并記錄大鼠呼吸及全身情況，以出現(xiàn)呼吸加快、口周發(fā)紺及腹肌痙攣、點(diǎn)頭呼吸為激發(fā)成功，共2128 d。分別于第35天，第42天處死大鼠。地塞米松組于每次誘喘前1h給予腹腔注射地塞米松1.0 mg/kg。對(duì)照組在相同的時(shí)間腹腔注射、霧化吸入0.9%生理鹽水，其余同哮喘組。    喘復(fù)康處方藥物由醫(yī)學(xué)院中

11、醫(yī)內(nèi)科提供，其主要成分為麻黃、杏仁、丹參、僵蠶、地龍、蘇子、白芥子、魚腥草、黃藤、甘草等。所有藥物經(jīng)浸泡、煎熬、過濾及濃縮成濃度為4 g生藥/ml的藥汁,將濃縮后的藥汁裝入已消毒的容器中,密封后再高溫滅菌,置于4冰箱保存用。于霧化攻擊前給予灌胃給藥,低高劑量組分別以50，100 g生藥/(kg?d) 灌胃。1.5   肺組織病理學(xué)觀察  末次激發(fā)結(jié)束后24 h內(nèi)處死，取右肺中葉組織，修塊，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片。行HE染色及Masson三色法染色。1.6  計(jì)算機(jī)圖象分析氣道壁厚度及膠原厚度  采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，每張切片在顯

12、微鏡下(400×)，確定完整的支氣管橫截面，分別選取6個(gè)完整的細(xì)支氣管截面，分別測(cè)取支氣管基底膜周徑（Pbm）、總管壁面積（WAt）、內(nèi)壁面積（WAi）以及平滑肌面積（WAm），并用Pbm將測(cè)量值標(biāo)化，分別以Wat/ Pbm、Wai/ Pbm及Wam/ Pbm代表相應(yīng)管壁層的厚度，并計(jì)算其平均值。Masson三色染色法使膠原纖維呈綠色，IMG-Q500圖像采集系統(tǒng)采集圖像，找到完整的支氣管橫截面，圖像分析膠原厚度。1.7   免疫組織化學(xué)染色  CD44免疫組化染色采用SABC法。切片脫臘、水化后3%H2O2室溫下反應(yīng)10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，

13、微波修復(fù)抗原，滴加正常牛血清封閉液，室溫10 min。滴加適當(dāng)稀釋（1100）的一抗免抗鼠CD44多克隆抗體，4下過夜，PBS充分沖洗后滴加生物素化山羊抗兔IgG，37下反應(yīng)20 min，滴加試劑SABC, 37下反應(yīng)20 min后DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水充分洗滌。蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、封片觀察。計(jì)算機(jī)圖象半定量分析系統(tǒng)測(cè)取管壁陽性染色的灰度值作相對(duì)含量，隨機(jī)選取6個(gè)支氣管，圖像分析各支氣管細(xì)胞染色的灰度值。1.8  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  各組間數(shù)據(jù)均以(±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間比較首先采用方差齊性檢驗(yàn)，組間差別采用單

14、因素方差分析及q檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用直線相關(guān)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2  結(jié)果2.1  病理組織學(xué)改變  各組肺組織石蠟切片常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn),哮喘3周組，支氣黏膜皺襞增多，上皮脫落，氣道平滑肌的厚度明顯增加，黏膜下、管壁及肺泡間質(zhì)均見有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，管腔狹窄；4周組上述改變更加明顯。激素組和喘復(fù)康合劑組僅有輕度的炎癥反應(yīng)，支氣管及肺泡炎性細(xì)胞浸潤明顯輕于哮喘組。Masson三色法染色法結(jié)果顯示，哮喘組支氣管黏膜及上皮下膠原纖維呈綠色，其分布明顯增多，4周組較3周組更為明顯；激素組和喘復(fù)康合劑組上皮下基底膜膠原沉積不明顯

15、，與正常對(duì)照組相比無顯著性差異。見圖110。圖1  CD44免疫組化染色空白對(duì)照（×20）（略）       圖2  正常組CD44免疫組化染色（×20）（略） 圖3  哮喘3周組CD44 免疫組化染色（×20）（略）         圖4  哮喘4周組CD44免疫組化染色（×20） （略）  圖5  地米3周組CD4

16、4免疫組化染色（×20）（略）      圖6  地米4周組CD44免疫組化染色（×20） （略）圖7  低劑量3周組CD44免疫組化染色（×20）（略）       圖8  低劑量4周組CD44免疫組化染色（×20） （略）圖9  高劑量3周組CD44免疫組化染色（×20）（略）        圖

17、10  高劑量4周組CD44免疫組化染色（×20）（略） 2.2  各組平滑肌面積及厚度、膠原厚度比較  用支氣管基底膜周徑標(biāo)化總管壁面積、內(nèi)壁面積和平滑肌面積為WAt/ Pbm,WAi/ Pbm及WAm/ Pbm，代表相應(yīng)管壁層的厚度。哮喘模型組支氣管平滑肌明顯增厚，膠原沉積增加，4周組比3周組更為明顯，與正常對(duì)照組及各給藥組比較有顯著性差異。激素組及喘復(fù)康大劑量組平滑肌增厚不明顯，與正常對(duì)照組相比無顯著性差異。見表1。表1  各組不同時(shí)期平滑肌和膠原厚度比較（略）與正常對(duì)照組比較，?P<0.05，與哮喘模型組比較，P<

18、0.05；n=82.3  氣道壁CD44免疫組織化學(xué)表達(dá)改變  氣道壁CD44主要表達(dá)在氣道黏膜上皮細(xì)胞胞膜，炎性細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、支氣管平滑肌未見表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示，CD44在正常對(duì)照組氣道壁弱陽性表達(dá)，激發(fā)3周時(shí)，在哮喘模型組氣道黏膜上皮穩(wěn)定陽性表達(dá)，4周時(shí)表達(dá)更為明顯。在喘復(fù)康小劑量3周干預(yù)組其表達(dá)低于哮喘模型組但無顯著性差異(P>0.05)，與正常對(duì)照組、喘復(fù)康大劑量干預(yù)組、激素干預(yù)組比較均偏高(P>0.05)；激素干預(yù)組及喘復(fù)康大劑量組CD44表達(dá)明顯較哮喘模型組低(P<0.05)。見表2。2.4  相關(guān)性分析 

19、; 經(jīng)直線相關(guān)分析得知，氣道壁CD44含量與平滑肌厚度呈顯著正相關(guān)（r=0.741,P<0.01）,與膠原厚度也呈顯著正相關(guān)（r=0.774,P<0.01）。表2  各組不同時(shí)期肺組織CD44免疫組化學(xué)定量分析結(jié)果（略）與正常對(duì)照組比較，?P<0.05，與哮喘模型組比較，P<0.05；n=83  討論    研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞黏附分子中糖蛋白及其黏附機(jī)制可能是介導(dǎo)哮喘時(shí)炎性細(xì)胞浸潤、增殖乃至纖維化形成的分子基礎(chǔ)。CD44是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白分子，屬于未分類的黏附分子，通過介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的特異性黏連，刺激多

20、種細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，而具有增高氣道反應(yīng)性、促使氣道重塑發(fā)生的作用，與哮喘的發(fā)病密切相關(guān)3。Katoh等4通過在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD44單克隆抗體(KM201或IM7)可以顯著減少嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在肺內(nèi)的聚集，提示白細(xì)胞特別是嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向肺部炎癥組織趨化浸潤有賴于CD44分子參與,并且通過炎癥細(xì)胞的破壞和分解導(dǎo)致局部損傷，進(jìn)而引起上皮和基底的破壞和萎縮，直至重塑形成。Ohkawara等5報(bào)道致敏哮喘大鼠BALF中的嗜酸粒細(xì)胞明顯增加，可能是通過CD44-HA途經(jīng)實(shí)現(xiàn)的。    轉(zhuǎn)化生長因子1（TGF-1）是哮喘氣道重塑的主要調(diào)控因子，其具有促膠原

21、產(chǎn)生、增加細(xì)胞外基質(zhì)沉積、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡等重要作用6。CD44可通過介導(dǎo)炎性細(xì)胞分泌產(chǎn)生大量TGF-1,喘復(fù)康合劑可能通過減少氣道壁TGF-1的表達(dá)而抑制氣道重塑。    本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠OVA致敏的哮喘模型，測(cè)定了致敏不同時(shí)段肺組織中CD44表達(dá)量的變化，觀察哮喘不同時(shí)段支氣管肺組織的組織學(xué)改變及基底膜膠原沉積情況，并觀察比較應(yīng)用中藥合劑喘復(fù)康以及激素治療對(duì)于氣道重塑的影響。喘復(fù)康由我校中醫(yī)內(nèi)科提供，是根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)和改良的治療哮喘的方劑。支氣管哮喘屬中醫(yī)學(xué)中“哮證”范疇，哮病的病因多以肺虛、脾虛、腎虛為本，以風(fēng)、寒、濕、痰、熱、淤為標(biāo)。方中甘草、麻黃具有松弛支氣管平滑肌作用；地龍通過抗組織胺作用而擴(kuò)張支氣管；杏仁、蘇子、白芥子、僵蠶等具有祛痰降氣作用，減輕肺氣壅塞，使呼吸較通暢而有助于止喘、降低氣道反應(yīng)性。諸藥合用補(bǔ)益