人源性單克隆抗體AT4對卵巢癌ao1017細胞的細胞毒性作用

1、    人源性單克隆抗體AT4對卵巢癌ao10/17細胞的 細胞毒性作用*        摘要目的和方法：本研究應(yīng)用MTT比色法分析人源性單克隆抗體（HMcAb）AT4對于人卵巢癌細胞ao1017的體外細胞毒。結(jié)果：HMcAb AT4 能激活人和家兔血清補體介導(dǎo)的ao1017細胞的細胞溶解，介導(dǎo)人效應(yīng)細胞對于靶腫瘤細胞的抗體依賴細胞毒，增強人LAK細胞對于ao1017細胞的殺傷作用。結(jié)論：HMcAb AT4在體外可介導(dǎo)對于人卵巢癌細胞的抗體依賴效應(yīng)細胞的細胞毒和補體

2、依賴細胞溶解，因而可能成為卵巢癌免疫治療研究特別有希望的試劑。主題詞抗體，單克??；抗體依賴細胞細胞毒性；補體；殺傷細胞，淋巴因子激活；卵巢囊腫 Cytotoxicity of human monoclonal antibody AT4 against culturedhuman ovarian cancer cells ao10/17WU Shu-Yun， WEN Gan-Sheng， XU Fang-Yun， LIU Qiu-Ru， GONG Wen-Hua， YU YingDepartment of Pathophysiology and Tumor Immunology Research

3、,Jiangxi Medical College,Nanchang （330006）Abstract AIM and METHOD: The in vitro cytotoxicity of human monoclonal antibody (HMcAb) AT4 against human ovarian cancer cells ao10/17 was analysed by using MTT colorimetric assay. RESULTS: HMcAb AT4 activated human and rabbit complement-mediated cytolysis o

4、f ovarian cancer cells ao10/17, mediated antibody- dependent cytotoxicity of human effector cells aganist ao10/17 cells and enhanced the cytotoxicity of lymphokine-activated killer cells against ao10/17. CONCLUSIONS: HMcAb AT4 did mediate antibody-dependent cytotoxicity of effector cells and complem

5、ent-dependent cytotoxicity, against cultured ovarian cancer cells, and therefore it seems to be especially promising in the immunotherapy of human ovarian cancer.MeSH Antibodies, monoclonal; Antibody-dependent cell cytotoxicity; Complement; Kill cell, lymphokine-activated； Ovarian cysts雜交瘤技術(shù)及其所產(chǎn)生的單克

6、隆抗體（monoclonal antibody,McAb）為腫瘤的診斷和治療帶來了極大的機遇。由于卵巢癌細胞表達許多高水平的抗原，因此，卵巢癌病人已被作為McAb治療的主要研究對象之一13。最近，我們采用體外免疫和DNA轉(zhuǎn)染相結(jié)合的技術(shù)路線，制得了抗卵巢癌人源性單克隆抗體(human monoclonal antibody,HMcAb )AT4，它能與人體組織和血清中的卵巢癌相關(guān)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)4,5。本文報道應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl terazolium bromide，MTT）比色法分析HMcAb AT4 對人卵

7、巢癌細胞的體外細胞毒，為HMcAb AT4的體內(nèi)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。材料與方法一、主要試劑和儀器：RPMI 1640為Gibco公司產(chǎn)品。小牛血清和MTT為上海華美公司出售。96孔細胞培養(yǎng)板為Costar公司產(chǎn)品。酶標(biāo)儀為南京華東電子管廠產(chǎn)品。二、HMcAb：將本室采用體外免疫和DNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建的分泌HMcAb AT4的永生化淋巴細胞系培養(yǎng)于含10小牛血清RPMI 1640培基中，取其培養(yǎng)上清作為HMcAb AT4 的來源。三、細胞和細胞株：人脾細胞：來自一附院外科脾破裂患者手術(shù)切除脾組織，制成懸浮細胞。LAK(lymphokine-activated killer）細胞：常規(guī)分離外周血單個核細胞

8、（peripheral blood mononuclear cells,PBMC），活細胞大于95。以2×109L細胞濃度置于含5×105UL 白介素-2（interleukin-2，IL-2）和15小牛血清的RPMI 1640培基中，37、5CO2孵育箱中培養(yǎng)5d后為LAK細胞。小鼠巨噬細胞：來自BALBc小鼠腹腔磷酸緩沖鹽水（phosphate buffered saline，PBS）沖洗液。ao1017人卵巢癌細胞株：引自中國科學(xué)院細胞生物學(xué)研究所細胞庫，在含10小牛血清的RPMI 1640培基中貼壁生長，乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraace

9、tic acid,EDTA）處理后，滴管吹下，經(jīng)PBS洗滌后，懸于含5小牛血清的RPMI 1640培基中備用。四、MTT法：按Mosmann的方法并加以改良。五、補體依賴性細胞毒作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）：將體外培養(yǎng)的人卵巢癌細胞ao1017以109L（10 L孔）接種于96孔細胞培養(yǎng)板，加入未稀釋的含HMcAb AT4 的培養(yǎng)上清（50 L孔），37孵育30 min；加入1/4和1/8稀釋的人或兔血清（50 L孔）。設(shè)不加抗體和補體的對照組。每組均為4個平行孔。置37，5CO2孵育箱中培養(yǎng)4h、24h。實驗終止前4h加入MTT（5gL）

10、10 L孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h；用10 SDS-0.01 mol/L HCl終止反應(yīng)。590 nm波長測OD值，按下列公式計算細胞殺傷率：六、抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）：在96孔細胞培養(yǎng)板中，實驗組加入ao1017（109L）10 L孔和未稀釋的含HMcAb AT4 的培養(yǎng)上清液50 L孔，37孵育30min；加入效應(yīng)細胞（1010個L）50 L孔；設(shè)效應(yīng)細胞對照組和靶細胞對照組。每組做4個平行孔；置于37、5CO2孵育箱中培養(yǎng)4h、24 h、48 h。終止前4 h加MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；1

11、0SDS-0.01 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。590 nm波長測OD值。按下列公式計算細胞殺傷率：殺傷率1(實驗組OD值效應(yīng)細胞對照組OD值)/靶細胞對照組OD值×100結(jié)果一、HMcAb AT4 介導(dǎo)的補體依賴細胞溶解：用人卵巢癌細胞ao1017和人與家兔血清補體分別測定HMcAb AT4 的補體依賴細胞毒（CDC）；結(jié)果如表1所示，在作用時間4h或24 h時，HMcAb AT4 均介導(dǎo)補體依賴ao1017細胞溶解。表1人源性單克隆抗體AT4介導(dǎo)的補體依賴細胞溶解Tab 1 Complement-dependent cytolysis mediated by HMcAb AT

12、4Group Culture duration(h)424(1) ao10/17 +AT4+HC (1:4)26.38% 34.18%(2) ao10/17 +AT4+HC (1:8) 28.87% 42.77%(3) ao10/17 +AT4+RC (1:4) 32.68% 22.12%(4) ao10/17 +AT4+RC (1:8) 36.85% 29.75%     ao10/17=ovarian cancer cell line； AT4 = human monoclonal antibody against ovarian cancer ；

13、HC=human complement；RC=rabbit complement 二、HMcAb AT4 介導(dǎo)人效應(yīng)細胞的細胞毒性作用：用人卵巢癌細胞ao1017和人脾細胞測定HMcAb AT4 的抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒（ADCC）；作用時間為4 h、24 h、48 h。結(jié)果如1所示，特異性抗體依賴性細胞溶解的發(fā)生呈時間依賴關(guān)系。靶腫瘤細胞的特異性溶解時間在48h最大，達100。     Fig 1 Antibody-dependent human and mouse effector cell cytotoxicity mediated by HMc

14、Ab AT4 (<"Image76 (855 bytes)" src="/med/cano/201003/20100310163143119" 13 22>±s,n=4)*P0.01，vs mouse effector cell group 1HMcAb AT4介導(dǎo)的抗體依賴人和小鼠效應(yīng)細胞毒三、HMcAb AT4介導(dǎo)的鼠效應(yīng)細胞的細胞毒作用：用ao1017和鼠巨噬細胞測定HMcAb AT4 介導(dǎo)的ADCC。結(jié)果如1所示，特異性抗體依賴性細胞溶解作用在4h和48h均不發(fā)生，在24 h時殺傷率僅為7.1，與人效應(yīng)細胞相比，在統(tǒng)計學(xué)上有

15、非常顯著差異（P0.01）。四、HMcAb AT4 對LAK細胞介導(dǎo)的細胞毒的增強效應(yīng)：結(jié)果如2所示，LAK細胞加HMcAb AT4組的殺傷率在4 h時為73.53，比LAK細胞組的殺傷率60.09高13.44（P0.05）；在24 h時LAK加HMcAb AT4 的殺傷率為100，比LAK組的殺傷率70.98高29.02（P0.01）。     Fig 2 Augmentation by HMcAb AT4 of LAK cell mediated cytotoxicity (<"Image76 (855 bytes)" sr

16、c="/med/cano/201003/20100310163143119" 13 22>±s)*P0.05，*P0.01，vs LAK group 2 HMcAb AT4對LAK細胞介導(dǎo)的細胞毒的增強作用討論目前，腫瘤相關(guān)抗原McAb的體外效應(yīng)與其在體內(nèi)的作用的關(guān)系還不十分了解。但有證據(jù)提示，它們對于人體腫瘤的生長抑制和破壞可能發(fā)揮重要作用。大量臨床前動物實驗表明，人體腫瘤移植物的生長抑制作用，只在具有細胞毒的鼠McAb的介導(dǎo)下才能達到6。Dyer等7用大鼠抗體對惡性淋巴瘤病人進行臨床試驗表明，只有體外介導(dǎo)ADCC的抗體才有效排除腫瘤和骨髓中的腫瘤細胞。從

17、此可看出，ADCC似乎是McAb抑制人體腫瘤生長的至關(guān)重要的一種功能。Liu等8報道，抗B淋巴細胞抗原CD20鼠抗體2H7不能介導(dǎo)ADCC和CDC，但其與人1恒定區(qū)所構(gòu)建的嵌合抗體則能激活這兩種功能。Mueller等報道9，人鼠嵌合抗體CH14.18介導(dǎo)人效應(yīng)細胞對于黑色素瘤細胞的抗體依賴細胞毒的效率比鼠McAb14.G2a高50100倍；由于鼠抗體的Fc段不象人的那樣有效地活化效應(yīng)細胞。但CH14.18和14.G2a兩者都能活化人補體介導(dǎo)的靶腫瘤細胞溶解。LAK細胞與抗癌McAb的聯(lián)合應(yīng)用是當(dāng)前頗受重視的抗癌免疫治療策略。但McAb對于LAK細胞毒的加強作用尚未完全確定。最近，Schmoll

18、ing等10報道，用鼠McAb B72.3治療31例卵巢癌病人，在手術(shù)和化療后，反復(fù)（平均4次）注射1mg McAb，其中19例有臨床療效,并表現(xiàn)體液免疫反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)：HMcAb AT4在體外能活化人和家兔血清補體介導(dǎo)的靶腫瘤細胞溶解；能介導(dǎo)人效應(yīng)細胞對于靶腫瘤細胞的抗體依賴細胞毒，而幾乎不能介導(dǎo)鼠巨噬細胞的細胞毒；能增強LAK細胞對于靶腫瘤細胞的細胞毒。上述結(jié)果表明，HMcAb AT4能介導(dǎo)對于卵巢癌細胞的補體依賴細胞溶解和抗體依賴人效應(yīng)細胞介導(dǎo)的細胞殺傷作用，因而可能成為人卵巢癌免疫治療研究特別有希望的一種新試劑。* 國家自然科學(xué)基金（39460031）和江西省自然科學(xué)基金（94516

19、）資助作者單位:江西醫(yī)學(xué)院病理生理教研室、腫瘤免疫研究室 （南昌 330006）參考文獻1 Rubin SC.Monoclonal antibodies in the management of ovarian cancer.Cancer,1993,71:1 602.2 Wagner U. Antitumor antibodies for immunotherapy of ovarian carcinoms. Hybridoma,1993,12:521.3 Schmolling J, Reinsberg J, Wagner U, et al. Antiidiotypic antibodies

20、in ovarian cancer patients treated with the monoclonal antibody B72.3. Hybridoma,1995,14:183.4 鄔淑云，溫淦升，徐方云，等. 人源性單克隆抗體識別的血清卵巢癌相關(guān)抗原. 江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 1998，38（1）：1. 5鄔淑云，溫淦升，徐方云，等. 卵巢癌組織表達人源性單克隆抗體識別的腫瘤相關(guān)抗原. 江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 1998，38（2）：1.6 Reisfeld RA, Cheresh DA. Human tumor antigens.In: Dixon FJ. ed. Advances in immunology. Vol 40. New York: Academic Press,1987. 323.7 Dye